成年小鼠心臟c-kit+干細胞的分離及誘導分化

文德重，周敏，薛松，姜愛俠，黃日太(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海007； 上海交通大學醫學院附屬兒童醫學中心)

成年小鼠心臟c-kit+干細胞的分離及誘導分化

文德重1，周敏1，薛松1，姜愛俠2，黃日太1
(1上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200127；2 上海交通大學醫學院附屬兒童醫學中心)

目的 從成年小鼠心臟中分離、純化c-kit+干細胞，并觀察其誘導分化結果。方法 取C57BL/ 6雄性小鼠3只，取心臟組織，將心臟解離成單個細胞。采用CD45磁珠、c-kit磁珠分選得到c-kit+干細胞。鑒定細胞純度，觀察細胞表型。觀察所得心臟c-kit+干細胞球的形成情況，對其進行誘導分化，采用RT-PCR法觀察誘導分化細胞血管平滑肌細胞的標志物α-SMA和sm-22α、血管內皮細胞標志物vWF、心肌細胞標志物cTnT、心臟干細胞標志物c-kit，觀察誘導分化的細胞表型。結果 心臟c-kit+干細胞c-kit+純度為89.3%，心臟干細胞表面表達c-kit抗體。原代c-kit+干細胞生長緩慢，傳代后細胞生長較快，懸浮培養可形成心臟c-kit+干細胞球。與誘導第0天比較，誘導分化第14 d時心臟干細胞α-SMA、sm-22α、vWF、cTnT mRNA相對表達量升高，c-kit mRNA相對表達量降低,P均<0.05。心臟c-kit+干細胞在心肌細胞誘導分化培養基中培養14 d左右可見cTnT陽性細胞。心臟干細胞在無LIF的培養基中培養14天可見vWF、α-SMA陽性細胞。結論 成功從成年小鼠心臟分離心臟c-kit+干細胞，所得c-kit+干細胞c-kit+純度高，可成功誘導分化為心肌細胞、血管平滑肌細胞及血管內皮細胞。

心臟干細胞；c-kit+干細胞；干細胞移植；缺血性心臟病

缺血性心臟病的發病率呈上升趨勢[1]。干細胞移植修復梗死心肌是一種新興的治療方法。研究[2～4]表明，心肌梗死后，心臟干細胞移植可有效抑制心肌細胞的凋亡，改善患者心功能，同時移植后的心臟干細胞可分化為血管細胞和心肌細胞，改善缺血心肌的血液供應情況。心臟干細胞可取自患者自身，解決了臨床關于胚胎干細胞的倫理、免疫排斥和致畸問題[5]，是目前細胞移植的研究熱點。c-kit是一種干細胞因子受體，是干細胞的經典特征性標記。普通的剪碎消化分離心臟干細胞的方法操作時間長、細胞損傷大，不利于細胞存活。建立一種簡便、經濟的干細胞分離方式，是目前亟需解決的問題。我們采用一種由蛇形冷凝管、循環水浴鍋、蠕動泵簡易組合的裝置，從成年C57BL/ 6小鼠心臟分離、純化c-kit+干細胞，并觀察其誘導分化結果，并鑒定其功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 6～8周齡SPF 級C57BL/ 6雄性小鼠3只，體質量18～20 g之間，購于上海杰思捷實驗動物有限公司。蛇形冷凝管、蠕動泵、循環水浴鍋。心肌灌注液的配制: 配制500 mL心肌灌注液，灌注液含113 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.6 mmol/L KH2PO4、0.6 mmol/L Na2HPO4、1.2 mmol/L MgSO4、10 mmol/L Na-HEPES、12 mmol/L NaHCO3、10 mmol/L KHCO3、0.032 mmol/L酚紅、30 mmol/L牛磺酸、5.5 mmol/L D-葡萄糖。心肌消化液的配制:用上述心肌灌注液，配制含1 mg/mL Ⅱ型膠原酶、50 μmol/L CaCl2的消化液、0.22 μm濾網過濾除菌，4 ℃保存。心臟干細胞全培養基制備：DMEM/F12，10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，10 ng/mL LIF，bFGF(10 ng/mL)，EGF(20 ng/mL)，1% ITS，1% B-27，0.5% N-2。心肌誘導分化培養基制備：α-MEM，10% FBS，1 μmol/L地塞米松，50 μg/mL 抗壞血酸，1 mmol/L β-磷酸甘油，1% 雙抗。

1.2 心臟c-kit+干細胞的分離、純化及培養 取C57BL/ 6雄性小鼠3只，麻醉下無菌條件于升主動脈第一分支游離心臟，懸掛灌流裝置，預冷灌注液灌注去除血液后，切換成心肌消化液，心肌消化液灌注前氧飽和10～15 min，37 ℃灌注10 min，流量控制為4 mL/min。經該裝置灌流10 min后，心臟變白，松軟。將心臟轉移至預冷含2%FBS的DMEM-F12-Ham′s培養基中，并用剪刀將心臟分離成小塊，將心臟解離成單個細胞。40 μm濾網過濾，300 g/min離心1 min去除心肌細胞。330 g/min離心7 min,去除上清,沉淀重懸于CD45磁珠分選buffer中，并加入CD45磁珠孵育30 min，MACS分選CD45-細胞。在CD45-細胞中STEM CELL c-kit磁珠分選試劑盒分選c-kit+細胞。分選得到的c-kit+干細胞接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2孵箱中培養。

1.3 心臟c-kit+干細胞純度分析及其表型鑒定

1.3.1 心臟c-kit+干細胞純度分析 采用流式細胞術。胰酶消化“1.2”中分選得到的心臟c-kit+干細胞P1代細胞，1% BSA封閉5 min，重懸于100 μL PBS中，分別加入抗小鼠c-kit PE、CD45 FITC流式抗體2 μL，4 ℃避光孵育30 min，1 mL PBS洗滌，重懸于100 μL PBS，流式細胞儀檢測分選后心臟c-kit+干細胞純度。實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 心臟c-kit+干細胞表型鑒定 采用免疫熒光染色法。“1.2”中分選得到的心臟c-kit+干細胞 P1代細胞制成細胞爬片，1∶200濃度的兔抗鼠c-kit免疫熒光抗體4 ℃過夜孵育，1∶500濃度的594驢抗兔二抗，常溫避光染色1 h，DAPI染色15 min，封片，免疫熒光顯微鏡拍片，觀察分選后的心臟干細胞表面是否表達c-kit抗體，如表達c-kit抗體染色為紅色。

1.4 心臟c-kit+干細胞球的形成情況觀察 將傳代培養得到的心臟c-kit+干細胞置于超低吸附板中，使用去除LIF的全培養基懸浮培養2～3天后，顯微鏡觀察心臟c-kit+干細胞成球形成情況。

1.5 心臟c-kit+干細胞球的誘導分化情況觀察

1.5.1 心臟c-kit+干細胞球的誘導分化 將“1.4”中形成的心臟c-kit+干細胞球接種于1 μg/mL層粘連蛋白包被的爬片上，心肌誘導培養基培養。誘導當天記為第0 天，貼壁誘導8 d 后撤除地塞米松、抗壞血酸、磷酸甘油，繼續培養至14 d，進行心肌方向誘導分化。接種于1 μg/mL層粘連蛋白包被的爬片上的干細胞球，去除LIF的全培養基培養14 d，進行血管內皮和平滑肌細胞方向分化。

1.5.2 誘導分化的細胞分化標志物檢測及表型觀察 ①細胞分化標志物檢測:采用RT-PCR法。分別取適量誘導第0天、誘導第14天的細胞，分別采用血管平滑肌細胞的標志物α-SMA和sm-22α、血管內皮細胞標志物vWF、心肌細胞標志物cTnT、心臟干細胞標志物c-kit等的引物進行PCR 擴增。樣品電泳完畢后，將凝膠放入ChemiDoc MP 凝膠成像系統觀察拍照。然后使用ImageJ軟件進行灰度值分析。②細胞分化表型觀察:采用免疫熒光染色法。 將誘導分化的心肌細胞、血管平滑肌細胞、血管內皮細胞的爬片拿出，分別加入1∶200濃度的兔單克隆抗體α-SMA、兔單克隆抗體vWF、鼠單克隆抗體cTnT免疫熒光抗體，4 ℃過夜孵育，分別加入1∶500濃度的594驢抗兔二抗、488驢抗兔二抗、488驢抗鼠二抗常溫避光染色1 h，DAPI染色15 min，封片，免疫熒光顯微鏡拍片,觀察細胞分化情況。鏡下可見vWF陽性細胞說明細胞已誘導分化為血管內皮細胞、鏡下可見α-SMA陽性細胞說明細胞已誘導分化為血管平滑肌細胞。

2 結果

2.1 心臟c-kit+干細胞純度和表型 心臟c-kit+干細胞c-kit+純度為89.3%，CD45+陽性細胞純度為0.0%。鏡下可見分選后的心臟干細胞表面表達c-kit抗體。

2.2 心臟c-kit+干細胞球形成情況 原代c-kit+干細胞分離后生長緩慢，2～3 d貼壁，10～14 d可長到80%，傳代后生長較快，2～3 d可長到80%。懸浮培養2～3 d時可見心臟c-kit+干細胞相互聚集，形成心臟c-kit+干細胞球。非心臟干細胞逐漸死亡。將心臟c-kit+干細胞球接種到laminin包被的板中，心臟干細胞很快貼壁，并從干細胞球中爬出細胞，向四周擴散。

2.3 不同誘導分化時間的心臟c-kit+干細胞α-SMA、 sm-22α、vWF、cTnT、c-kit mRNA相對表達量比較及誘導分化結果 不同誘導分化時間細胞α-SMA 、 sm-22α、vWF、cTnT、c-kit mRNA相對表達量比較見表1。

心臟c-kit+干細胞在心肌細胞誘導分化培養基中培養14天左右，免疫熒光染色鑒定，可見cTnT陽性細胞。心臟干細胞在無LIF的培養基中培養14天，免疫熒光染色可見vWF、α-SMA陽性細胞。

表1 不同誘導分化時間細胞α-SMA 、 sm-22α、vWF、cTnT、c-kit的mRNA相對表達量比較±s)

注：與誘導分化第0天相比，*P<0.05 ，**P<0.01。

3 討論

2003年Beltrami等[6]發現心臟c-kit+干細胞能夠自我更新，在體外可分化為心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞，心肌注射心臟c-kit+干細胞后可改善梗死心臟的心功能，為梗死后心功能恢復提供新的治療思路。隨后研究又發現了一些其他不同類型的干細胞，如sca-1+、側群干細胞、心肌球干細胞等細胞[7～9]。但是有研究認為，c-kit+較sca-1+干細胞具有更強的組織修復能力[10, 11]。c-kit+干細胞因此也成為了干細胞移植的備選種子細胞，成為研究熱點。

Langendorff消化酶灌流裝置為心臟解離的經典方法，但是其價格昂貴，體積大，不能放于超凈臺中，無法保證分離過程中的無菌，而限制了其使用。普通的剪碎消化解離心臟的方法又因消化時間較長，需要反復消化[12]，而對心臟干細胞損傷較大，不利于干細胞存活。組織塊爬細胞的分離方法，需要將心臟組織塊剪碎后種植到培養板里，待細胞從組織塊中爬出后再消化分離，所需時間較長[13]，不適合急性分離。本實驗中我們使用冷凝管進行心肌灌注、酶解，同樣可以起到文獻[14]中Langendorff灌流、酶解的效果，且由于冷凝管體積較小，鐵架臺固定后可放于超凈臺中，可以為分離過程提供相對清潔的環境而避免細菌污染。心臟灌注10 min后，心臟變白、變軟，吸管輕輕吹打可將心臟解離成單個細胞，消化效果較好。消化液灌注前進行氧飽和10～15 min，可在灌注過程中為干細胞供氧，減輕心臟干細胞的缺氧損傷。心臟肥大細胞也表達c-kit表面標志[15]，所以實驗中應通過分離CD45+細胞去除心臟干細胞中肥大細胞的干擾。經CD45和c-kit磁珠雙分選后得到的心臟c-kit+干細胞c-kit+純度純度為89.3%。說明經磁珠分選后，可以得到較純的心臟c-kit+干細胞，經CD45磁珠分選得到CD45-細胞，可以去除同樣表達c-kit的肥大細胞的干擾，保證了心臟原位干細胞的純度。我們將分選的心臟干細胞培養24 h后更換培養孔，此時心臟干細胞由于尚未貼壁，可進一步去除成纖維、內皮等易于貼壁的細胞，進一步提高分選后的純度。分選后的心臟干細胞呈小、圓、亮的細胞，折光性強，2～3 d貼壁，增殖速度較慢，傳代后增殖速度較快，可傳10代以上，懸浮培養后可在培養基中形成球，與文獻中報道一致[6, 16]。在培養中我們發現，細胞干性會有丟失，純度下降，可能與細胞過密生長，傳代不及時，導致細胞分化有關，與ES培養過程中易于分化相似。雖然過去人們認為心臟c-kit+細胞是心肌干細胞，但是近期Sultana等[17]研究發現，心臟c-kit+細胞不是心肌干細胞，而是內皮祖細胞。Liu等[18]利用譜系示蹤技術發現，心臟c-kit+細胞在心肌損傷后很少分化為心肌細胞，而是分化為內皮細胞和炎癥細胞。我們在心臟干細胞培養過程中，發現在去除維持細胞干性的LIF后，心臟干細胞可自發向血管內皮細胞和平滑肌細胞分化，免疫熒光染色可見vWF和α-SMA陽性細胞，RT-PCR結果顯示vWF、α-SMA、sm-22α表達較培養第0天明顯增強，印證了心臟c-kit+細胞不是心肌干細胞，而是內皮祖細胞的結論。但是分選后的c-kit+細胞在心肌細胞分化培養基中還是可以分化為表達心肌細胞特殊標志的細胞，RT-PCR顯示cTnT表達呈強陽性，免疫熒光可以看到cTnT陽性細胞。雖然c-kit+細胞向內皮細胞自發分化的潛能大于向心肌細胞分化的潛能，但仍具有多向分化潛能。

我們在實驗中使用冷凝管成功解離了心臟，心臟灌注后可解離成單個細胞，解離效果較好，重復性好，方法簡便且經濟。最終成功從成年小鼠心臟分離心臟c-kit+干細胞，所得c-kit+干細胞c-kit+純度高，且培養后能形成心臟c-kit+干細胞球，可成功誘導分化為心肌細胞、血管平滑肌細胞及血管內皮細胞。但心臟干細胞移植后存活率、分化率低的問題仍需進一步解決。

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Isolation and differentiation of c-kit+cardiac stem cells from adult mice

WENDezhong1,ZHOUMin,XUESong,JIANGAixia,HUANGRitai

(1RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To isolate the c-kit+stem cells from the hearts of adult mice, and to explore the induced differentiation of cardiac stem cells (CSC). Methods The freshly isolated hearts were obtained from 3 male C57BL/6 mice, and the hearts were dissected into single cells. The c-kit+stem cells were isolated from the CD45-cells by magnetic microbeads. Flow cytometric analysis and Immunofluorescence were used to measure the purity and the phenotype of c-kit+cells. The cell purity was determined and cell phenotype was observed. The c-kit+cells were cultured in suspension medium to form the CardioStem sphere. RT-PCR was used to analyze the expression of the smooth muscle cells marker (α-SMA and sm-22α), endothelial cells marker (vWF), myocardial cells marker (cTnT) and cardiac stem cells marker (c-kit) after differentiation. Immunofluorescence was used to measure the phenotypes after the differentiation. Results The purity of c-kit+reached 89.3%, and the cardiac stem cells expressed the c-kit antibody. The primary cells grew slowly, but faster after being passaged. When cultured in suspension, the cells can form the CardioStem sphere. The expression of α-SMA, sm-22α, vWF, and cTnT mRNA was significantly increased, but the expression of c-kit mRNA was significantly decreased on day 14 as compared with that on day 0 after differentiation (allP<0.05). cTnT-positive cells were observed in cardiomyocyte-induced differentiation medium for about 14 days in cardiac c-kit+stem cells. vWF positive cells and α-SMA positive cells were observed in the medium without LIF on day 14. Conclusion Highly purified c-kit+CSCs can be isolated and cultured from the hearts of adult C57BL mice, c-kit+CSCs can be differentiated into cardiomyocytes, smooth muscle cells, and endothelial cells.

cardiac stem cells; c-kit+stem cells; stem cell transplantation; ischemic heart disease

上海市科學技術委員會資助項目(134119a5602)。

文德重(1990-)，男，醫學碩士，主要研究方向為心肌損傷的修復。E-mail: wendezhongwencong@163.com

黃日太(1970-)，男，博士，碩士生導師、主任醫師,主要研究方向為房顫的治療和心肌損傷修復。E-mail: ahtai1018@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.005

R541.75

A

1002-266X(2017)07-0016-04

2016-11-30)