局部125I粒子植入聯合丹皮酚灌胃對裸鼠肺癌移植瘤的治療觀察

鄧詠梅，李園，張金山，劉少顏(廣州醫科大學附屬第三醫院，廣州510150)

·基礎研究·

局部125I粒子植入聯合丹皮酚灌胃對裸鼠肺癌移植瘤的治療觀察

鄧詠梅，李園，張金山，劉少顏
(廣州醫科大學附屬第三醫院，廣州510150)

目的 觀察局部125I粒子植入治療聯合丹皮酚灌胃對A549裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤效果，并探討其可能作用機制。方法 Balb/c裸鼠52只，均制作A549裸鼠肺癌移植瘤模型，隨機分成A、B、C、D組，每組13只。A組采用丹皮酚150 mg/kg灌胃治療，1次/d,共治療14 d；B組采用直視下經皮穿刺125I(0.4 mci/粒)放射性粒子植入術治療；C組先行125I粒子植入聯合治療，后采用150 mg/kg丹皮酚灌胃, 1次/d,共治療14 d；D組為“冷粒子”(表觀活度為0)植入對照。 治療14 d時處死各組裸鼠，稱取瘤重(g)，計算腫瘤體積、腫瘤抑制率。觀察各組腫瘤組織細胞凋亡情況，檢測各組腫瘤細胞水通道蛋白5(AQP5)、生存素(Survivin)蛋白。結果 治療14 d時A、B、C組瘤重均低于D組(P均<0.05)，A、B、C組腫瘤體積均小于D組(P均<0.05)；A、B、C組抑瘤率分別為35.6%、57.3%、74.4%，組間兩兩比較，P均<0.05。A、B、C、D組細胞凋亡指數分別為20.15%±3.07%、46.00%±12.00%、67.30%±9.80%、9.49%±1.52%，組間兩兩比較，P均<0.05。A、B、C、D組AQP5蛋白的陽性表達率分別為30.1%±8.5%、27.3%±5.4%、33.9%±7.6%、28.4%±6.1%，B、D組比較，P<0.05。A、B、C、D組Survivin蛋白的陽性表達率分別為18.0%±7.0% 、16.0%±5.0% 、9.5%±2.4%、43.0%±11.0%, 組間兩兩比較，P均<0.05。結論 局部125I粒子植入聯合丹皮酚灌胃對A549裸鼠肺癌移植瘤的的抑瘤效果較好，其機制可能與其上調腫瘤組織AQP5蛋白表達、下調Survivin表達，促進腫瘤細胞凋亡。

肺癌；肺腫瘤；丹皮酚；125I粒子植入治療；水通道蛋白5；生存素

肺癌是目前我國惡性腫瘤致死的主要原因。放療是目前臨床常用的肺癌局部治療方法，其適用范圍廣，但部分肺癌患者特別是非小細胞肺癌患者的放射敏感性較低，治療過程中可產生放射抗拒，導致放療效果不佳[1]。125I粒子植入治療是一種新興的內照射放射治療方法，其可提高腫瘤患者的腫瘤局部控制率[2]，已被用于用于肺癌、胃癌等多種實體瘤及術后殘存腫瘤的治療中。丹皮酚是牡丹、芍藥根皮中的活性成分,既往研究發現其對人乳腺癌細胞EMT6、食管癌細胞Eca-109、人結腸癌LoVo細胞等多種腫瘤有明顯的抑制作用[3～5]，是一種新的多靶點抗癌劑。最新研究[6，7]認為,丹皮酚與化療藥物或放療藥物聯用可起到協同抗腫瘤作用。但目前關于關丹皮酚與125I粒子植入治療肺癌的相關報道較少。本研究觀察了局部125I粒子植入治療聯合丹皮酚灌胃對A549裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤效果，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 A549裸鼠肺癌移植瘤模型制作及分組 取7～10周的Balb/c裸鼠52只，雌雄不限，體質量17.5～21.3 g，動物合格證號為44007200025334。由廣東省實驗動物中心制作A549裸鼠肺癌移植瘤模型5，腫瘤長徑7～8 mm，平均7.1 mm。將52只裸鼠隨機分成A、B、C、D組，每組13只，常規飼養后備用。

1.2 各組125I粒子局部植入與丹皮酚干預方法 A組采用丹皮酚(購自廣州晶晶生物科技有限公司，純度99.3%)150 mg/kg灌胃治療，1次/d,共治療14 d；B組采用直視下經皮穿刺125I(0.4 mci/粒)放射性粒子植入術治療：125I放射性粒子由天津賽德醫藥科技有限公司提供，單粒籽源表觀活度為14.8 MBq。固定裸鼠后顯露瘤體，消毒瘤體及周圍皮膚，選擇瘤體中央部位為進針點，將125I粒子置于5 mL針尖上，穿刺針(芯)穿刺后將125I粒子推入瘤體中，退出穿刺針，輕壓穿刺部位。將裸鼠放回飼養籠內。每個腫瘤植入1顆125I粒子；C組先行直視下經皮穿刺125I粒子植入術，后采用150 mg/kg丹皮酚灌胃治療, 1次/d,共治療14 d；D組為“冷粒子”(表觀活度為0)植入對照。

1.3 各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率、合并用藥效應測算 治療第14 天處死各組裸鼠，完整剝出腫瘤組織并稱重(g)，測量腫瘤的三維徑長(a、b、c,cm)，按公式V=a×b×c/6 計算腫瘤體積(V,cm3)，根據腫瘤瘤重計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-干預組平均瘤重)/ 對照組平均瘤重×100%。根據Webb分數乘積法測算C組的合并用藥效應。(fa)1,2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]。(fa)1和(fa)2分別為藥物的瘤質量抑制率，(fa)1，2為理論相加效應，如果合并用藥效應大于理論相加效應，則表示有協同作用，如果合并用藥效應等于理論相加效應，則表示有相加作用。

1.4 各組腫瘤組織細胞凋亡情況觀察 采用TUNEL法觀察各組腫瘤組織細胞凋亡情況。TUNEL試劑盒購自德國羅氏公司，所有操作均嚴格按照試劑說明書進行。在高倍視野下隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，觀察細胞凋亡情況，鏡下細胞核、細胞質內濃染致密的塊狀熒光為陽性細胞，否則為陰性細胞，計算各組細胞凋亡指數(AI)。AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5 各組腫瘤組織AQP5、Survivin蛋白檢測 采用免疫組化染色法檢測各組細胞AQP5、Survivin蛋白。AQP5兔單克隆抗體試劑(批號EPR3747)為美國abacm公司產品，一抗兔抗Survivin多克隆抗體試劑為美國Thermo Fisher Scientific Inc 產品。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。AQP5、Survivin蛋白表達情況見圖1。Survivin陽性表達為胞質和或細胞核呈棕黃色或棕褐色著染, AQP5陽性表達為細胞膜或細胞質呈棕黃色，細胞核不著色。計算AQP5、Survivin陽性表達率(陽性細胞數/總細胞數×100%)。

注：左為Survivin陽性表達；右為AQP5陽性表達。

圖1 AQP5、Survivin蛋白表達情況

2 結果

2.1 各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較 治療14 d時各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較見表1。C組合并用藥理論效應為72.5%，而實際抑瘤率為74.4%。

表1 治療14 d時各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較±s)

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，&P<0.05。

2.2 各組腫瘤組織AI比較 A、B、C、D組AI分別為20.15%±3.07%、46.00%±12.00%、67.30%±9.80%、9.49%±1.52%，組間兩兩比較，P均<0.05。各組細胞凋亡情況見圖2。

圖2 各組細胞凋亡情況

2.3 各組腫瘤組織AQP5、Survivin蛋白陽性表達率比較 A、B、C、D組AQP5蛋白陽性表達率分別為30.1%±8.5%、27.3%±5.4%、33.9%±7.6%、28.4%±6.1%，B、D組比較，P<0.05；A、C組AQP5蛋白陽性表達率高于D組，但P>0.05。A、B、C、D組Survivin蛋白陽性表達率分別為18.0%±7.0% 、16.0%±5.0% 、9.5%±2.4%、43.0%±11.0%, 組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

125I粒子植入治療被認為是一種具有高度適形的放療，可長時間、緩慢持續低劑量照射腫瘤本身，利用射線的電離輻射作用使腫瘤細胞產生輻射損傷，進而抑制腫瘤細胞的增殖、促進細胞凋亡。但其存在劑量分布不均勻且依賴放射源的幾何空間排布的特點，可能導致治療靶區熱點或冷點的出現，影響對腫瘤的控制。電離輻射損傷是放射治療的基礎,輻射損傷作用的關鍵靶點是細胞核內的DNA。中藥丹皮酚是牡丹、芍藥根皮中的活性成分,其藥理活性十分廣泛，對多種腫瘤有明顯的抑制作用，其抗腫瘤的分子機制之一是下調COX-2的表達，抑制Bcl-2基因、Survivin的表達，誘導細胞凋亡[4，6]。丹皮酚與化療藥物或外照射放射線聯用，起協同抗腫瘤作用[6,7]，何峰等[7]研究發現,本研究結果發現，采用丹皮酚灌胃、125I粒子植入內照射及聯合治療均能抑制A549肺腺癌的生長，且聯合用藥的抑瘤率高達74.4%，明顯高于丹皮酚、125I粒子單獨應用時的抑瘤率，提示丹皮酚聯合125I粒子植入治療對A549肺癌有協同抗腫瘤的作用。促進細胞凋亡是125I粒子植入治療和丹皮酚灌胃抑制腫瘤生長的重要機制，本研究中，D組腫瘤細胞結構清晰可見，形狀、大小各異，細胞核大而濃染；A、B、C組腫瘤組織鏡下可見腫瘤細胞數量減少，緊貼125I粒子周邊可見大片紅染壞死區，腫瘤組織壞死明顯，部分腫瘤細胞核出現核仁邊界不清、核破碎、核固縮。且A、B、C組AI高于D組，提示丹皮酚聯合125I粒子植入治療可促進腫瘤細胞的凋亡。

AQP5主要位于呼吸道上皮表層的柱狀上皮細胞頂膜和黏膜下腺腺泡細胞頂膜，是一種高度選擇性的水通道蛋白，其主要作用是參與水的轉運，維持細胞內外水平衡，并參與調節肺臟黏液、唾液分泌及眼淚的產生[8]。因此猜測：上調腫瘤細胞AQP5表達、開放水通道將致腫瘤細胞內水含量增加，可望產生更多的氫氧自由基(OH·)，將形成更多DNA雙鏈斷裂，增加了間接輻射損傷，從而提高腫瘤細胞的放射敏感性，可見AQP5的表達將對腫瘤細胞的放射敏感性產生重要的影響[9]，AQP5有可能是一種新型的輻射敏感標志物和內源性輻射增敏劑，丹皮酚對人A549肺腺癌腫瘤組織AQP5的表達上調不明顯，原因可能為丹皮酚能夠上調AQP5的表達，因為在治療早期AQP5變化尚不明顯或丹皮酚對AQP5的表達呈劑量依賴性，此次實驗的劑量沒達到閾值，或確實對AQP5的表達沒有調節作用，這些都有待于做大樣本實驗來進一步探索。

放射增敏劑能提高腫瘤細胞對射線的敏感性，從而增強射線對腫瘤細胞的殺傷力。文獻[10]報道，腫瘤細胞Survivin的表達與腫瘤細胞的放射敏感性有關，頭頸部、結直腸惡性腫瘤細胞對放射的抗拒與Survivin高表達有關。本研究發現，與D組比較，各治療組的Survivin蛋白的表達均降低，C組的Survivin蛋白表達率降至9.5%±2.4%，與A、B組比較，差異有統計學意義，提示丹皮酚與125I粒子植入治療聯用可明顯下調Survivin蛋白表達，提高腫瘤細胞對射線的敏感性，天然藥物丹皮酚可作為放射增敏劑用于腫瘤放療中。

綜上所述，125I粒子植入治療聯合丹皮酚對A549肺癌裸鼠的的抑瘤效果較好，兩者聯合應用可克服單一內照射治療的不足且產生協同抗腫瘤的作用，可提高治療療效，其機制與下調Survivin表達、提高腫瘤細胞對射線的敏感性及促進細胞凋亡有關。但腫瘤的增殖受諸多因素的調控，且丹皮酚聯合125I粒子植入治療的具體作用機制尚需通過時間依賴性、劑量依賴性實驗等進一步研究來證實。

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廣東省中醫藥局建設中醫藥強省科研課題基金資助項目(20151277)。

張金山(E-mail: zhangjinshangd137@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.009

R734.2

A

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2016-08-30)