食管鱗狀細胞癌組織中磷酸化表皮生長因子受體的表達變化及其意義

于瑞冉,曾薇,單莉(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊830011)

·臨床研究·

食管鱗狀細胞癌組織中磷酸化表皮生長因子受體的表達變化及其意義

于瑞冉,曾薇,單莉
(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊830011)

目的 觀察食管鱗狀細胞癌(以下簡稱食管鱗癌)組織中磷酸化表皮生長因子受體(P-EGFR)的表達變化，并探討其意義。方法 100例食管鱗癌患者，手術治療中均留取癌組織(觀察組)和癌旁正常組織(對照組)，采用免疫組化SP法檢測兩組組織中磷酸化EGFR(P-EGFR)，分析P-EGFR的表達與食管鱗癌臨床病理參數及患者預后的關系。結果 觀察組癌組織中P-EGFR的表達高于對照組(P<0.05)。P-EGFR的表達與食管鱗癌患者腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期等臨床病理參數無關(P均>0.05)。P-EGFR低表達者總生存期、無病生存期均長于P-EGFR高表達者(P均<0.05)。多元Cox回歸分析結果表明P-EGFR高表達是影響食管鱗癌生存時間的獨立危險因素。結論 食管鱗癌組織中P-EGFR高表達。P-EGFR高表達是影響食管鱗癌生存時間的獨立危險因素，P-EGFR可能是一個預測食管鱗癌患者預后的獨立因素。

食管腫瘤；食管癌；食管鱗狀細胞癌；表皮生長因子受體

食管鱗狀細胞癌(以下簡稱食管鱗癌)發病率位居我國惡性腫瘤發病率的第5位[1]。表皮生長因子受體(EGFR)是多數生長因子、細胞因子調控細胞增殖的重要途徑，參與細胞分化發育、細胞周期循環調控、細胞間功能同步等多種生理病理過程[2～4]。研究發現，EGFR在許多腫瘤中被磷酸化激活，而激活的磷酸化EGFR(P-EGFR)具有酪氨酸激酶活性，能將一系列細胞外生長因子信號傳導到細胞內，是維持癌細胞增殖、侵襲、轉移、復發的重要條件[5，6]，并可能是肺癌、胃癌、大腸腺癌等腫瘤早期診斷、預后判斷及靶向治療的可靠靶點。目前關于其在食管鱗癌中的研究報道較少。本研究觀察了食管鱗癌組織中P-EGFR的表達變化，分析其與食管鱗癌臨床病理參數及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇新疆醫科大學附屬腫瘤醫院自2006年1月～2009年12月收治的食管鱗癌患者100例，其中男71 例、女29例，年齡47～80(60.4±8.3)歲；術前均未接受放療、化療等其他抗腫瘤治療；腫瘤分級、TNM分期均采用2010年AJCC公布的最新標準(第七版)；手術中均留取癌組織(觀察組)和距離腫瘤組織5 cm以外的癌旁正常組織。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 兩組P-EGFR檢測方法 鼠抗人P-EGFR單克隆抗體購自Santa Cruz公司(sc-166260)；鼠/兔免疫組織化學試劑盒(HRP-anti-Rabbit/Mouse，Kit-9720)、蘇木素染色劑、DAB顯色劑購自福州邁新生物技術開發公司。采用免疫組化SP法檢測兩組組織中P-EGFR，用正常鱗狀上皮組織作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。操作步驟參照試劑盒說明書稍加改進，具體如下：所有組織標本固定、包埋，抗原修復，室溫下自然冷卻，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加過氧化物酶阻斷試劑，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，滴加正常非免疫動物血清，室溫下孵育10 min；除去血清，滴加鼠抗人P-EGFR抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，滴加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶試劑，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加新鮮配制的DAB試劑顯色；顯微鏡下觀察染色情況，及時自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。正常鱗狀上皮組織中，P-EGFR陽性表達主要定位于細胞膜和細胞質上，基底細胞以及副基底細胞不表達或弱表達。隨機選取10個高倍鏡視野(200×)，至少計數1 000個細胞的染色情況，分別按照細胞著色強度和著色細胞百分比計分[5]：細胞無著色計0分、淺黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；陽性細胞≤5%計0分、5%～30%計1分、31%～60%計2分、≥60%計3分；上述兩項分值的和為樣本最后得分，0～3分表示P-EGFR低表達、4～6分表示P-EGFR高表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。P-EGFR表達與分化程度、淋巴結轉移及臨床分期等臨床病理參數比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，并行Log-rank檢驗；將單因素分析中P<0.05的因素進行多因素分析。多因素分析采用Cox逐步回歸法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組組織P-EGFR表達比較 觀察組、對照組組織P-EGFR的陽性表達率分別為64%(64/100)、12%(12/100)，兩組相比，P<0.05。

2.2 P-EGFR表達與食管鱗癌臨床病理參數的關系 單因素分析顯示，P-EGFR的表達與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、原發腫瘤直徑(T分期)、淋巴結轉移(N分期)、臨床分期(TNM分期)均無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 P-EGFR表達與食管鱗癌患者預后的關系 100例患者中共84例獲得隨訪，其中P-EGFR高表達、低表達者分別為57、27例，截止日期2015年12月，中位隨訪時間38個月。P-EGFR高表達、低表達者的總生存期分別為(41.6±3.3)、(55.3±5.2)月，二者相比，P<0.05；P-EGFR高表達、低表達者的無病生存期分別為(26.5±3.7)、(45.7±6.3)月，二者相比，P<0.05。Kaplan-Meier分析結果顯示，P-EGFR的表達與食管鱗癌患者的總生存時間(χ2=5.79，P=0.016)及無病生存時間(P=0.004)均呈負相關(圖1)。COX風險比例模型對患者性別、年齡、P-EGFR、分化程度、T分期、N分期、TNM分期等進行多因素回歸分析，結果顯示P-EGFR高表達與總生存時間及無病生存時間均相關(P均<0.01)。

表1 不同臨床病理參數食管鱗癌患者的P-EGFR表達(例)

圖1 P-EGFR表達與食管鱗癌患者總生存時間、無病生存時間的關系

3 討論

EGFR為細胞膜表面的糖蛋白受體，屬于原癌基因C-erb-1表達產物。相關研究[7]表明，EGFR表達與細胞特異性分化具有密切關聯，其高水平表達可促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移。EGFR以單體形式存在于細胞膜上，而單體無活性，其激活依賴于其配體及其他 Erb B家族成員存在，如表皮生長因子、雙向調節蛋白及轉化生長因子α等[8]。當EGFR與其配體結合后，可改變構象，EGFR形成同源二聚體或者與其他成員形成異源二聚體，進而激活酪氨酸酶區，導致自身磷酸化或者轉磷酸化，形成P-EGFR，進而引起下游信號通路Ras/Raf/絲裂原細胞外激酶/細胞外信號調節激酶一絲裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的磷酸化級聯反應，促進信號傳導的激活，依次觸發基因轉錄，調控細胞的生長、分化、血管生成及凋亡[5,9]，介導腫瘤細胞的增殖、侵襲及分化等。Hiraishi等[10]研究發現，口腔鱗癌組織中P-EGFR表達的陽性率(98%)較高，同時發現其與腫瘤分期和淋巴結轉移無關，提示P-EGFR高表達可能成為預測口腔鱗癌極好的分子標志之一。此外，胃腸道類癌、胰腺內分泌腫瘤以及乳腺癌組織中P-EGFR均呈高表達[11,12]。且發現高表達P-EGFR的胰腺內分泌腫瘤患者與低表達或不表達P-EGFR的患者相比，預后更差，提示P-EGFR在腫瘤的發生和預后中起重要作用。

本研究中，我們通過免疫組織化學染色對臨床手術取得的食管鱗癌蠟塊標本進行EGFR磷酸化水平檢測，分析了P-EGFR與食管鱗癌患者臨床病理特征、患者術后無病生存時間及總生存時間的關系。結果發現，觀察組癌組織中P-EGFR的表達高于對照組，與以往研究報道一致[13]。P-EGFR的表達與食管鱗癌患者腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期等臨床病理特征無關。這與國內外在口腔鱗癌和非小細胞肺癌中的研究結果基本一致[11]，表明P-EGFR表達水平可能與腫瘤的惡性生物學行為無關。但盧紅等[14]報道，P-EGFR表達與食管鱗癌患者是否有淋巴結轉移有關，淋巴結轉移組患者的P-EGFR高表達率高于無淋巴結轉移組，這可能與樣本量、研究對象、研究方法、結果判定標準等有關，具體原因尚需進一步研究。在預后分析中，P-EGFR低表達者總生存期、無病生存期均長于P-EGFR高表達者。多元Cox回歸分析結果表明P-EGFR高表達是影響食管鱗癌生存時間的獨立危險因素,與Papouchado等[11]研究結果類似，證實P-EGFR表達是判斷食管鱗癌患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，食管鱗癌組織中P-EGFR高表達。P-EGFR高表達是影響食管鱗癌生存時間的獨立危險因素，P-EGFR可能是一個預測食管鱗癌患者預后的獨立因素。但P-EGFR表達是否可作為食管鱗癌患者的預后指標尚需進一步擴大樣本量研究證實，更需要一項大型多中心雙盲實驗研究來證實P-EGFR表達在食管鱗癌組織中的相關作用。

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新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2015211C137)。

單莉(E-mail： shanlimed@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.014

R735

B

1002-266X(2017)07-0046-03

2016-10-06)