LncRNAs作為miRNA的靶模擬物調節miRNA

王曦++陳定

摘 要：miRNA的主要作用是降低靶基因的翻譯效率和/或降低mRNA的水平，而lncRNA可作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與其他mRNA（如miRNA靶基因）競爭結合相同的miRNA，從而干擾miRNA對靶基因的抑制。全轉錄組測序可同時獲得lncRNA和mRNA的表達信息，miRNA測序結合降解組測序可鑒定miRNA及其調控的靶基因。進一步結合蛋白表達分析，鑒別miRNA對其靶基因的調節層次（降解mRNA和/或阻遏翻譯），同時還可解析lncRNA在miRNA調節靶基因這個過程中的角色和功能。

關鍵詞：長鏈非編碼RNA 競爭性內源RNA 小RNA 高通量測序

中圖分類號：Q811.4 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2016）10（a）-0176-02

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）主要包括microRNA（miRNA，miR）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）兩大類RNA。已鑒定的ncRNA幾乎參與了基因信息傳遞的各個環節，包括基因轉錄調控、基因印跡與沉默、mRNA的穩定和翻譯、蛋白質的轉運和定位等。

1 miRNA調節靶基因的機制

miRNA是長短約22 nt的短鏈RNA，在進化上具有高度保守性，主要通過與靶基因（targets）3非編碼區上的結合位點互補結合，能夠通過抑制靶基因miR-tgs的翻譯或降解靶基因mRNA，從而抑制靶基因的表達。然而miRNA結合在靶基因編碼區（CDS）導致翻譯抑制，而結合3非編碼區傾向于導致mRNA降解。利用核糖體譜可以度量miRNA對其靶基因翻譯的抑制效應，同時分析其對靶基因mRNA水平的抑制/剪切效應。擬南芥的核糖體譜分析表明，大多數miRNA靶點在CDS區（77%），因而miRNA靶基因的核糖體印跡少較，miRNA表現出翻譯抑制效應，而且miRNA主要抑制靶基因的翻譯起始。

miRNA靶基因預測工具psRNATarget結合了植物中miRNA靶識別的一些特征，可區分miRNAs對其靶基因的剪切和翻譯抑制。因而再結合降解組測序分析，可以分揀出在翻譯水平上受miRNAs抑制的其靶基因。

2 LncRNAs作為miRNA的靶模擬物調節miRNA

長鏈非編碼lncRNA是一類長度超過200 nt的RNA分子，它們數目眾多、表達具組織特異性、極少具有蛋白編碼潛能，卻在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多種層面上調控基因的表達水平。

目前，通過分析植物的高通量測序數據，在擬南芥中鑒定了2 708個基因間的lncRNAs（Liu et al，2012）和70%已注釋mRNAs的反義lncRNAs（Wang et al，2014），在玉米中鑒定了1 704個高可信度lncRNAs（Li et al，2014b）和637個氮素響應的lncRNAs（Lv et al，2016），之后在其他植物如水稻（Zhang et al，2014）、棉花（Wang et al，2015）、番茄（Zhu et al，2015）、向日葵（Flórez-Zapata et al，2016）、楊樹（Shuai et al，2014；Tian et al，2016）等植物中也鑒定了基因間、內含子源和反義lncRNAs。目前植物非編碼數據庫GreeNC（greenc.sciencedesigners.com）收錄了37種植物共計12萬個lncRNAs（Paytuví Gallart et al，2016）。而做植物lncRNAs功能研究的也有1 187個，涵蓋43種植物（Xuan et al，2015），包括調節水稻光敏不育的LDMAR（Ding et al，2012）、調節擬南芥養分磷平衡的IPS1（Franco-Zorrilla et al，2007）和春化開花的COLDAIR（Heo and Sung，2011）以及側根發育的ASCO-lncRNA（Bardou et al，2014）。

競爭性內源RNA（ceRNA）能與其他RNA競爭結合相同的microRNA，從而調節miRNA的分布和miRNA靶基因的表達（Salmena et al，2011；夏天等，2012）。lncRNA利用其miRNA結合位點誘捕miRNA的方式屬于誘餌Decoy原型（Wang and Chang，2011）。部分lncRNA可作為競爭性內源RNA，如，肌分化長鏈基因間非編碼RNA1（linc-MD1）能通過競爭性結合miR-133和miR-135調控肌肉分化（Cesana et al，2011）。這種抑制miRNA功能的方式稱為模擬靶基因（Wu et al，2013）。

LncRNA可作為內源靶模擬物（endogenous microRNAtarget mimic，eTM）調節miRNA的表達和功能。利用擬南芥和水稻的RNA-Seq測序數據檢驗eTM是否表達，同時證實了幾個檢測到的eTM的確能夠抑制相應的miRNA（如miR160，miR166）功能。擬南芥中低磷誘導的lncRNA（包括IPS1）采取模擬靶基因的方式，解除miR399對靶基因PHO2的抑制，因而調節養分磷的動態平衡。關于lncRNA作為miRNA內源靶模擬物的研究只有幾例，包括擬南芥IPS1（Franco-Zorrilla et al，2007）以及擬南芥、水稻中保守的miR160和miR166的內源靶模擬物（Wu et al，2013），還有水稻中影響穗發育和育性的XLOC_057324（Zhang et al，2014），番茄中slylnc1077作為eTM影響sly-miR399（Wang et al，2015）。

樊春燕等（2014）整合miRNAs數據、cDNAs數據和降解組數據，利用生物信息學方法找到擬南芥337個成熟miRNAs在2 708個lincRNAs上的可能結合位點，構建了miRNAs-mRNAs-lincRNAs調控網絡，并根據競爭性內源（ceRNA）假說預測lincRNAs的功能。

目前miRNAs的靶標研究主要集中于編碼蛋白的基因，而對于靶標為非編碼RNAs的研究較少，尤其在植物中的研究更為少見，將降解組數據和miRNAs靶標預測結合是挖掘miRNAs與mRNAs及miRNAs與lincRNAs調控關系的有效手段。全轉錄組測序可同時獲得lncRNA和mRNA的表達信息，結合miRNA和降解組測序，在解析miRNA的靶基因的基礎上，還可確定miRNA的內源靶模擬物，再結合蛋白表達分析，進一步確定干擾miRNA抑制靶基因的競爭性內源ceLncRNA。接下來通過分析ceLncRNA的突變體和過表達水稻植株在Cd處理后miRNA/miRNA靶基因/celncRNA表達的變化，可評價競爭性內源ceLncRNA對miRNA的干擾效果。這樣不僅可鑒別miRNA對其靶基因的調節層次（降解mRNA/阻遏翻譯），同時還可解析lncRNA在miRNA調節靶基因這個過程中的角色和功能

長非編碼lncRNAs可作為miRNA的靶模擬物調節miRNA，可是基于富集polyA尾的常規RNA測序不能得到所有的lncRNA（低豐度而且有些無polyA尾），而lncRNA全轉錄組深度測序可同時獲得lncRNA和mRNA的表達信息，結合miRNA和降解組測序，可以在解析miRNA靶基因的基礎上，確定干擾miRNA抑制靶基因的競爭性內源lncRNA。進一步結合蛋白表達分析，鑒別miRNA對其靶基因的調節層次（降解mRNA和/或阻遏翻譯），同時還可解析lncRNA在miRNA調節靶基因這個過程中的角色和功能。

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