產β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構建及其發酵條件優化

葛 飛 唐 堯 朱龍寶 李藝雯 段振超 馬琪森 陶玉貴

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

產β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構建及其發酵條件優化

葛 飛 唐 堯 朱龍寶 李藝雯 段振超 馬琪森 陶玉貴

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

構建β-苯丙氨酸變位酶基因表達重組質粒pET-28a-pam，并轉化大腸桿菌BL21，獲得β-苯丙氨酸變位酶基因重組菌?？疾炫囵B基初始pH、搖床轉速、種齡、發酵時間以及裝液量5個因素對β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌產酶活性的影響，確定較佳發酵條件為：培養基初始pH 7.0、搖床轉速200 r/min、發酵時間24 h、裝液量50 mL/500 mL、種齡10 h。采用Box-Behnken試驗設計，選擇了種齡、初始pH、發酵時間3個對β-苯丙氨酸變位酶活力影響較大的因素進行響應面優化。優化結果為：在種齡12.8 h、初始pH 6.7、發酵時間25.2 h條件下，PAM活力達到11.15 U/mL，比優化前酶活4.87 U/mL提高了128.9%。

重組大腸桿菌；產酶條件；β-苯丙氨酸變位酶；發酵

β-苯丙氨酸氨基變位酶(β-Phenylalanine aminomutase，PAM)屬于MIO-依賴氨基變位酶(MIO-dependent aminomutase)，由于其特殊的催化特性可以在沒有輔酶因子的情況下催化α-苯丙氨酸轉化為β-苯丙氨酸[1-2]。β-苯丙氨酸可以作為食品添加劑改善食品香味，脫氫降解以后還可作為蜜餞的食品添加劑，改善蜜餞的口感風味，也可作為食品的無公害環保防腐劑。另外，β-苯丙氨酸還是目前最有效的抗癌藥物紫杉醇(Taxol)合成中的重要前體物質之一，自然界中僅在植物紅豆杉(Taxus L.)中發現含有PAM[3-4]。目前生產β-氨基酸的主要方法是化學拆分法和手性輔助劑合成法等[5-6]。這些方法合成過程復雜，生產成本高昂，產品需要多次結晶才能使用，且在生產過程中還會產生有毒有害的副產物，不能滿足實際需求，利用分子生物學方法構建工程菌是未來高效、快速、安全生產的趨勢[7-8]。目前中國對PAM的報道鮮有提及，國外研究主要集中在β-苯丙氨酸變位酶(PAM)生產β-苯丙氨酸的方法方面，Szymanski W等[9]利用PAM催化得到了α-苯丙氨酸與β-苯丙氨酸的1∶1的混合產物。Wu等[10]使用PAM的幾種突變型酶進行比較，選擇出了其中較高催化率的酶并研究探討了其催化機制。雖然有利用PAM催化生產β-苯丙氨酸的驗證以及機制原理研究，但未見利用重組大腸桿菌生產PAM并優化其發酵條件。因此構建PAM基因重組菌，并利用重組大腸桿菌生產PAM，優化其產酶條件具有一定的理論和實踐意義。本研究擬構建PAM重組大腸桿菌，研究不同發酵條件對β-苯丙氨酸重組菌產酶的影響，并采用響應面法對發酵條件進行優化，以提高PAM重組菌的產量，利用分子生物學手段和優化發酵條件得到一種新型、環保、高效的β-苯丙氨酸的生產方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21、質粒pET28a：本實驗室保藏；

DH5α-pam：蘇州金唯智生物科技有限公司；

限制性內切酶EcoRI、NdeI、Prime STAR DNA聚合酶：2.0×104units/mL，NEB公司；

SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、磁珠法DNA膠回收試劑盒、dNTP Mixture(每種8 μmol)：生工生物工程(上海)技術有限公司；

T4 DNA連接酶：4.0×105units/mL，生工生物工程(上海)技術有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取物：生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

葡氯化鈷、氯化銅、氯化錳、乙二胺四乙酸、硼酸、乙酸鋅、雙氨基甲烷、十六烷基三甲基溴華胺：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

卡那霉素、α-苯丙氨酸、β-苯丙氨酸：生物試劑，生工生物工程(上海)技術有限公司。

1.2 主要儀器設備

組合式全溫度震蕩培養箱：QHZ-123B型，太倉市華美生化儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

無菌操作臺：YJ-1450型，蘇州工業園區三興凈化技術有限公司；

紫外可見分光光度計：JH-723型，上海菁華科技儀器有限公司；

臺式低速離心機：L550型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

電子天平：YP-1002型，上海佑科儀器儀表有限公司；

數顯pH計：PHSJ-3F型，上海精密科學儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS型，上海申安醫療器械廠；

醫用數控超聲波清洗器：JK-2200型，合肥金尼克機械制造有限公司。

1.3 重組菌的構建

1.3.1 重組質粒pET-28a-pam的構建 依據NCBI所公布(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY724735.1； GenBank編號:AY724735.1)的paPAM基因序列以及Lei等[11]的研究成果設計上下游引物，上游引物p1：5-GGAATTCCATATGATGGGGTTTGCCGTGGAATCGCGTTCTCACG-3'；下游引物p2：5-CGGAATTCCTAGACGCCGTTGGCGCACCCA-TTTGGTTGG-3'。在LB培養基中隔夜培養DH5α-pam，利用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取其中質粒。使用50 μL體系在94℃預變性4 min、94℃變性1 min、58℃退火30 s、72℃延伸2 min條件下對其進行25個循環的PCR擴增，50 μL體系為：模板2 μL、Primerup 1 μL、Primerdown 1 μL、5×PSBuffer 10 μL、Prime STAR 0.5 μL、dNTPMixture 4 μL，利用無菌水補充到50 μL。PCR產物回收后使用EcoRI/NdeI在37℃恒溫水浴鍋中進行雙酶切4 h，雙酶切體系為：回收產物40 μL、EcoRI 0.5 μL、NdeI 0.5 μL、100×H Buffer 5 μL，利用無菌水補充到50 μL。電泳后使用磁珠法DNA膠回收試劑盒回收純化含有目的基因的片段，將純化產物與pET28載體在-16℃條件下進行連接，體系為：純化產物7 μL、pET-28 1.5 μL、10×Buffer 1 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL。1.3.2 PAM重組菌的構建 使用氯化鈣法制作BL21感受態細胞，利用構建出的表達載體pET-28a-pam和BL21感受態細胞進行KCM法轉化，得到重組大腸桿菌。

1.4 培養基配制

種子培養基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖1 g/L、卡那霉素0.5 g/L，pH 7.0；發酵培養基：磷酸二氫鉀13 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸鎂1.3 g/L、檸檬酸1.7 g/L、氯化錳1.5 g/L、氯化銅1.5 g/L、硼酸3 g/L、高猛酸鈉2.5 g/L、乙酸鋅13 g/L、乙二胺四乙酸8.4 mg/L、氯化鈷2.5 mg/L，pH 7.0。

1.5 培養方法

將菌種過夜活化后取1 mL放入50 mL種子培養基中，使用500 mL三角燒瓶進行搖床振蕩培養12 h，培養條件為200 r/min、30℃。以10%的接種量將種子培養基接入到100 mL的發酵培養基中，使用500 mL的三角燒瓶在200 r/min、30℃的條件下進行培養。16 h后于42℃誘導表達4 h，30℃繼續培養，直到可以檢測出酶活。

1.6 酶活測定

1.6.1β-苯丙氨酸標準曲線的繪制 詳細繪制方法見文獻[12～13]。分別取濃度為480 μg/mL和620 μg/mL的β-苯丙氨酸標準液5 mL加入到10 mL比色皿中，再分別加入1 mL的茚三酮試劑使其充分混合均勻。使用數顯恒溫水浴鍋在90℃下水浴25 min，冷卻至室溫。利用723型紫外可見分光光度計測量其在570 nm下的光吸光度，以標準液的吸光度和濃度作標準曲線。

1.6.2 測定方法 取5 mL菌種培養液4 000 r/min離心10 min，生理鹽水清洗,再次離心，用10 mL的25 mmol/L Tris—HCl溶液徹底懸浮細胞。取1 mL的懸浮液，用0.5 g/L 的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)于30℃水浴10 min，3 000 r/min離心10 min。沖洗沉淀，并加入50 mmol/Lα-苯丙氨酸溶液2.5 mL和25 mmol/L Tris—HCl 2 mL，40℃條件下反應10 min，以0.2 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應。離心后使用723紫外可見分光光度計測定其在570 nm下的吸光度。利用式(1)計算酶活：

(1)

式中：

U——酶活單位，U/mL；

V——反應體積，mL；

Mw——β-苯丙氨酸的分子質量；

C——β-苯丙氨酸的濃度，mg/L；

T——反應時間，min。

1.7 單因素試驗設計

1.7.1 初始pH的確定 以1.4中發酵培養基配方，在30℃、接種量10%、種齡12 h、搖床轉速200 r/min條件下，分別以初始pH值6.0，6.5，7.0，7.5，8.0振蕩培養16 h。按1.6 的方法檢測PAM酶活，考察初始pH對PAM酶活的影響。

1.7.2 種齡的確定 以1.4中發酵培養基配方，在30℃、接種量10%、初始pH 7.0、搖床轉速200 r/min條件下，分別接種種齡為8，10，12，14，16 h的種子培養液于100 mL發酵培養基中振蕩培養16 h。按1.6的方法檢測PAM酶活，考察不同種齡培養液對PAM酶活的影響。

1.7.3 發酵時間的確定 以1.4中發酵培養基配方，在30℃、接種量10%、種齡12 h、搖床轉速200 r/min、初始pH 7.0 條件下，分別于100 mL發酵培養基中培養20，22，24，26，28 h。按1.6的方法檢測PAM酶活，考察發酵時間對PAM酶活的影響。

1.7.4 裝液量的確定 以1.4中發酵培養基配方，在30℃、接種量10%、初始pH 7.0、搖床轉速200 r/min、初始pH 7.0條件下，分別于25，50，75，100，125 mL培養基中培養16 h。按1.6的方法檢測PAM酶活，考察裝液量對PAM酶活的影響。

1.7.5 搖床轉速的確定 以1.4中發酵培養基配方，在30℃、接種量10%、初始pH 7.0條件下，分別于100 mL發酵培養基中在160，180，200，220，240 r/min搖床速度下培養16 h。按1.6的方法檢測PAM酶活，考察搖床轉速對PAM酶活的影響。

根據單因素試驗結果，分析各個因素對產PAM的較佳條件。選擇對PAM產酶影響較大的3個因素，利用Design Expert軟件設計三因素三水平的Box-Behnken試驗，對種齡、初始pH、發酵時間3個發酵條件進行進一步優化。

2 結果與分析

2.1 PAM重組菌的構建

將構建菌株在37℃條件下培養1 h，然后涂布于抗性平板篩選陽性重組子。利用PCR進一步驗證重組子，提取重組菌的質粒(結構示意圖見圖1)，PCR擴增后使用EcoRI/NdeI進行雙酶切。得到目的條帶大小約為2 100 bp(見圖2)，與預期相符合，測序與NCBI所公布的paPAM基因序列相符。證明成功構建了含有目的基因的重組大腸桿菌。

2.2 單因素對重組菌產酶活的影響

2.2.1 初始pH對PAM酶活性的影響 由圖3可知，初始pH低于6.5時，PAM的活性明顯較低，可能與低pH值會影響菌株壽命和PAM酶活有關。在pH為6.5～7.0時，PAM酶活較高，pH為7.0時酶活最高達到5.77 U/mL；當pH超過7.0后，酶活呈下降趨勢，說明過高pH也會抑制PAM酶活。

圖1 pET-28a-pam結構示意圖Figure 1 pET-28a-pam Structure diagram

M. DL10000 marker 1. pET-28a-pam 2. pET-28a-pam digested with EcoR I/Mde I

圖3 初始pH值對PAM酶活性的影響Figure 3 Effects of initial pH value of fermentation medium on PAM activity

2.2.2 種齡對PAM酶活性的影響 由圖4可知，接種種齡小于10 h時的種子液，PAM酶活性呈遞增趨勢。種齡10 h的發酵液PAM酶活達到最大值(5.36 U/mL)，種齡超過10 h后，酶活呈現下降趨勢。小于10 h的種子活力不夠，生長速度較慢。10 h之后的種子開始老化，活力受到代謝副產物的影響進而導致酶活下降。

2.2.3 發酵時間對PAM活性的影響 由圖5可知，發酵時間在20～24 h時，PAM酶活逐步增大，在發酵時間為24 h時，PAM酶活達到最大值(5.47 U/mL)。發酵時間超過24 h后，PAM酶活快速下降，可能與菌株培養時間過長，菌體老化，發酵后期大量生成其它發酵產物有關。

圖4 種齡對PAM酶活性的影響Figure 4 Effects of inoculation time on PAM activity

圖5 發酵時間對PAM酶活性的影響Figure 5 Effects of fermentation time on PAM activity

2.2.4 裝液量對PAM活性的影響 由圖6可知，在500 mL三角瓶中裝入50 mL培養基進行培養時，發酵液中PAM酶活最高，為5.62 U/mL，裝液量在50～100 mL時，PAM酶活緩慢遞減，然后趨于穩定。這是由于裝液量逐步增大時搖瓶內的溶解氧含量下降，較低的氧濃度影響了菌體生長和代謝產物積累，致使PAM酶活下降。

圖6 裝液量對PAM酶活性的影響Figure 6 Effects of broth volume on PAM activity

2.2.5 搖床轉速對PAM活性的影響 由圖7可知，搖床轉速為200 r/min時，PAM酶活最大，為5.56 U/mL，大于或小于200 r/min時都會導致酶活下降。這是由于轉速過低會導致溶解氧不足，菌株生長、代謝受到抑制；而轉速過高會使菌株過快消耗培養基中的營養成分，初級代謝產物積累過快，影響PAM酶活性。

2.3 Box-behnken試驗分析

根據單因素的試驗結果，選取對PAM酶活影響較大的種齡、初始pH以及發酵時間作為優化對象。利用Design Expert軟件設計出三因素三水平的方案，設計的試驗因素和水平見表1。

圖7 搖床轉速對PAM酶活性的影響Figure 7 Effects of rotate speed on PAM activity

以Y(PAM活性)為響應值，利用Design Expert軟件分析表2中的試驗結果，可以得到X1、X2、X3的三元二次回歸方程：

(2)

表1 中心組合試驗三因素三水平表Table 1 Three main fermentation conditions and their three levels of optimization test based on central composition design principle

表2 Box-Behnken試驗設計及結果表Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.4 響應面分析

使用Design Expert軟件進行響應面分析，可以得到種齡、初始pH、發酵時間3個因素兩兩之間影響的關系。由圖8～10可知，每一個響應面都存在極值，即每一個影響因子對于PAM重組菌均存在一個最優條件；且等高線接近圓形，證明3個因素之間的交互作用不顯著。

經軟件計算，所選3個影響PAM產酶活性因素的最優組合為種齡12.8 h、初始pH 6.7、發酵時間25.2 h。上述3個數值均可以在實際操作中進行驗證。

2.5 實驗驗證結果

在所得的最優組合條件種齡12.8 h、初始pH 6.7、發酵時間25.2 h條件下，重復進行3次實驗，PAM酶活平均值為11.15 U/mL，與預測值誤差為6.4%，誤差值在10%以內，證明了利用響應面法優化重組菌產酶條件的準確性。在優化后發酵條件下，進行工程菌培養PAM酶活可達11.15 U/mL，比優化前提高了128.9%。

表3 參數估計及方差分析表?Table 3 Parameter estimates and analysis of regression equation obtained

圖8 種齡(A)和初始pH(B)交互影響PAM酶活性的響應面圖Figure 8 RSD figure of inoculation time (A) and initial pH value(B) interacting on PAM activity

圖9 種齡(A)和發酵時間(C)交互影響PAM酶活性的響應面圖Figure 9 RSD figure of inoculation time(A) and fermentation time(C) interacting on PAM activity

圖10 初始pH(B)和發酵時間(C)交互影響PAM酶活性的響應面圖Figure 10 RSD figure of initial pH value(B) and fermentation time(C) interacting on PAM activity

3 結論

目前β-苯丙氨酸的主要生產方法為化學合成法，其技術也相對成熟，但是生物酶法具有安全、清潔、高效的特點有著巨大的優勢，利用生物酶法制備β-氨基酸也被越來越多地關注。一些學者[11,14]在研究變位酶催化的機制，得到了關于PAM的催化機理以及催化特點，但仍然缺乏在生產、生活中利用PAM進行實際應用的研究，對β-苯丙氨酸日益增長的需求也未得到較好解決。

本試驗利用分子生物學手段構建出產PAM重組大腸桿菌，并對PAM重組菌的產酶條件優化，確定了重組菌較佳單因素試驗條件，即初始pH 7.0、種齡10 h、發酵時間24 h、裝液量50 mL、搖床轉速200 r/min。在此基礎上，利用響應面法得到了3個較主要影響因素的最佳組合為種齡12.8 h、初始pH 6.7、發酵時間25.2 h，進一步促進菌株發酵液中PAM酶活提高，為PAM在實際生產中的應用提供了試驗數據。然而，利用重組菌獲得PAM還存在著產量低，菌株穩定性不高等問題，各種條件的優化也還在進一步探索之中，利用工程菌產酶優化的方法、PAM的催化條件都尚需深入研究。

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Construction of recombinant E coli. of producingβ-phenylalanine aminomutase and optimization of fermentation conditions

GE FeiTANGYaoZHULong-baoLIYi-wenDUANZhen-chaoMAQi-senTAOYu-gui

(CollegeofBiologyandChemicalEngineering,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu,Anhui241000,China)

The genetic engineering strain with recombinant plasmid pET-28a-pam was expressed inE.coliBL21. The fermentation conditions of initial pH, shaking speed, inoculation time and fermentation time were optimized with the PAM activity by using single factor. The results showed that the optimal fermentation conditions were initial pH 7.0, 200 r/min, the tenth hour broth and liquid volume 50 mL/500 mL, fermented for 24 h. Furthermore, the three factors were optimized by Box-Behnken design, and the results showed that inoculation time, initial pH and fermentation time are main affecting factors and their optimal levels are 12.8 h, 6.7 and 25.2 h. Under the optimal conditions, th activity of PAM reached 11.15 U/mL, improved by 128.9% compared with that under initial culture conditions.

RecombinantEcoli.; Enzyme production conditions;β-phenylalanine aminomutase; fermentation

國家自然科學基金面上項目(編號：31671797)；安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(編號：KJ2016A801)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(編號：201510363072)

葛飛(1978—)，男，安徽工程大學副教授，博士。 E-mail: gerrylin@126.com

2016-12-17

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.004