群體感應抑制劑與磺胺甲惡唑、鹽酸強力霉素對大腸桿菌的聯合毒性及其機制初探

谷月，孫昊宇，葛鴻銘，馬清萍，林志芬,#，張飲江,,*

1. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306 2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟大學環境科學與工程學院，上海200092 3. 水域環境生態上海高校工程研究中心，上海201306

抗生素自發現以來，被廣泛地應用于臨床醫藥和生命科學等行業中，具有種類多、應用范圍廣等特點。其中，磺胺類抗生素因其性質穩定、價格低廉而被廣泛用于家畜飼料中來預防和治療家畜疾病[1]，2003年我國磺胺類藥物產量突破20 000 t 且一直持續增長。同時，另一類廣譜抗生素——四環素的應用也極為廣泛，占美國整個抗生素市場份額的15.8%；而我國是世界上四環素類抗生素的生產、使用和銷售大國，僅2014年我國四環素類抗生素的使用量就高達6 950 t[2-3]。但是，近年來抗生素濫用導致的抗性基因爆發及超級細菌出現等生態安全問題引發了人們的廣泛關注，抗生素替代品的探索及研發變得刻不容緩[4]。

群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitors，QSIs)是一種作用于群體感應(QS)系統的新型抗菌劑。研究表明，QSIs干擾細菌QS系統的方式主要包括與信號分子受體蛋白競爭性結合和誘導細菌產生可以使信號分子滅活的降解酶等途徑，因此具有不對細菌直接產生毒性作用、不對細菌施加選擇性生長壓力以及不易誘導細菌耐藥等特點[20]。近些年，越來越多研究者認為，QSIs可以作為一類傳統抗生素的可能替代品應用到相關行業中[5]。基于QSIs的遠大應用前景，環境中QSIs和傳統抗生素聯合暴露的可能性逐漸增大，因此對于它們聯合暴露所產生生態風險的研究迫在眉睫。

為了探究上述問題，本文以經典模式生物大腸桿菌[6-7](Escherichia coli)為受試生物，測定了7種QSIs(DL-焦谷氨酸、N-乙烯基吡咯烷酮、呋喃酮乙酸酯、2-甲基四氫呋喃-3-酮、3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮、(R)-3-吡咯烷醇、D-脯氨醇)分別與磺胺甲惡唑(SMX，磺胺類抗生素)和鹽酸強力霉素(DH，四環素類抗生素)的二元聯合毒性，判別其聯合作用類型，并對其作用機制進行初步探討，以期為傳統抗生素與QSIs聯合暴露的生態風險評價提供一定的科學依據和理論指導。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 生物與試劑

受試生物：Escherichia coli (MG1655)，購自Biovector Science實驗室。

化學試劑：7種QSIs包括DL-焦谷氨酸、N-乙烯基吡咯烷酮、呋喃酮乙酸酯、2-甲基四氫呋喃-3-酮、3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮、(R)-3-吡咯烷醇、D-脯氨醇，磺胺甲惡唑(SMX)和鹽酸強力霉素(DH)均購自Sigma-Aldrich化學制品有限公司(St.Louis，MO，USA)，純度均為分析純。具體信息如表1。

1.2 毒性試驗

毒性實驗方法參考文獻[8]。取待測化合物用適量DMSO配制成濃度較高的標準溶液，實驗時用1% NaCl稀釋成等對數梯度系列，加入96孔酶標板中，每孔共加入200 μL含有化合物、培養基及工作菌液的混合體，空白組以1%的NaCl代替化合物的部分，最后將培養體系在37 ℃下振蕩培養12 h。測試體系以吸光度OD為測試終點，采用全波長酶標儀在波長600 nm處測定OD值。以上樣品每次至少設置12個濃度梯度，3組平行。抑制率(P%)計算如式1：

(1)

表1 化合物相關信息表Table 1 Details of the test chemicals

式(1)中，OD0為E. coli在無染毒作用下的空白OD平均值，而OD為藥物作用下細菌的OD平均值。

二元混合實驗方法參照參考文獻[9]，根據單一化合物的EC50，配制A和B化合物等毒性比的混合溶液，按照單一毒性實驗方法測定混合溶液的毒性。TU50計算如式2。

(2)

式(2)中，CA和CB是混合體系在產生半數抑制效應時單一組分(A、B)的濃度，EC50A和EC50B分別是單一組分在產生半數抑制效應時的濃度。

對于混合物聯合效應的判別采用TU判別法進行，具體為[10]：當TU50<0.8時，化合物聯合作用為協同；當0.8≤TU50≤1.2時，化合物聯合作用為相加；當TU50>1.2時，化合物聯合作用為拮抗。

1.3 分子對接

使用Discovery Studio 3.1 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA) 對E. coli中目標蛋白(晶體三級結構)和目標小分子進行對接。根據化合物已有抑菌機制從PDB protein data bank (http://www.pdb.org) 獲取各類化合物的目標靶蛋白三級結構。本研究中，QSIs作用于E. coli的目標靶蛋白為LsrB或者SdiA，PDB ID分別為4LFD和1TJY。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 群體感應抑制劑(QSIs)與磺胺甲惡唑(SMX)、鹽酸強力霉素(DH)單一毒性及作用機制

本研究以log(1/EC50)作為指標來表征化合物毒性，QSIs、SMX和DH對E. coli的單一毒性大小見圖1。

圖1 單一化合物log(1/EC50)比較Fig. 1 Comparison of log(1/EC50) of single chemical

從圖1可以看出，所研究化合物毒性大小順序為：DH >SMX>QSIs(BRF > PA > FA > HPL > DP > MO > VP)。即QSIs的毒性明顯低于SMX和DH，QSIs中毒性最小的VP的log(1/EC50)比SMX的小5以上，比DH的小6以上。此外，雖然總體上7種QSIs的毒性大小相差并不大，但是BRF毒性卻大于其他幾個QSIs，這是因為BRF結構中含有雙溴基團導致其毒性變大[11]。

前人研究表明，細菌體內的氨基苯甲酸(PABA)與二氫葉酸合成酶(DHPS)結合生成二氫葉酸(DHFA)，調控細菌核蛋白的合成，從而促進細菌的生長繁殖[19]；磺胺類藥物(SAs)的化學結構與PABA非常相似，可與PABA競爭DHPS從而抑制二氫葉酸的形成，最終發揮抑菌作用[12]。而鹽酸強力霉素的抑菌作用表現為通過與核蛋白體的30S小亞基結合，阻止氨酰基-tRNA同核蛋白體(RNP)結合，從而抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白的合成[13]。

E. coli自身不能產生AI-1類信號分子(高絲氨酸內酯類化合物)，只能產生AI-2類信號分子(呋喃酮類化合物)，它的群體感應系統有2條：1)細菌自身產生AI-2信號分子，AI-2被位于周質空間的蛋白LsrB感應到，通過轉運系統被運到細胞質中后與LsrR蛋白結合，改變LsrR的構象[14]，解除LsrR對lsrACDBFGE基因抑制作用，而該群體感應系統在細菌代謝過程中起到關鍵作用。2)細菌接收外源的AI-1信號分子，靶蛋白是SdiA，結合體可以調控ftsQAZ操縱子的表達，而表達的FtsZ蛋白是細胞分裂激活因子，因此促進了細胞分裂[15-16]。當大腸桿菌暴露在QSIs中時，QSIs可以和AI-2或AI-1競爭結合它們各自的靶蛋白LsrB或SdiA，起到抑菌作用。

2.2 群體感應抑制劑(QSIs)與磺胺甲惡唑(SMX)、鹽酸強力霉素(DH)的聯合毒性及其機制初探

7種QSIs分別與SMX、DH的二元毒性實驗結果如表2所示。

由表2可看出，前5種QSIs與SMX、DH聯合作用均為相加，后2種QSIs與SMX、DH聯合作用均為拮抗。那么，QSIs與SMX、DH聯合作用時為什么會有相加和拮抗2種不同的結果呢？

前文提到，E. coli有2條群體感應系統，由此我們推測不同QSIs可能作用于E. col的不同群體感應系統，導致與SMX、DH的聯合作用不同。當QSIs作用于AI-2介導的群體感應系統時與AI-2競爭結合LsrB蛋白，當QSIs作用于AI-1介導的群體感應系統時與AI-1競爭結合SdiA蛋白。因此，我們將7種QSIs分別與LsrB和SdiA蛋白進行了分子對接(圖2，Ebinding值見表3，可以看出：1) 7種QSIs與LsrB和SdiA蛋白均以氫鍵發生結合；2) 前5種QSIs與LsrB形成的氫鍵數量較后2種QSIs多，結合更為緊密，如PA與LsrB形成2個氫鍵，與SdiA只形成一個氫鍵；3)后2種QSIs與SdiA形成的氫鍵數量較前5種QSIs多，結合更為緊密，如HPL與LsrB僅有一個氫鍵，而與SdiA形成2個氫鍵。根據7種QSIs分別與SMX、DH的聯合作用類型和它們分別與LsrB、SdiA蛋白的分子對接結果，我們將前5種QSIs歸為第I類QSIs(作用于AI-2群體感應系統)，將后2種QSIs歸為第II類QSIs(作用于AI-1群體感應系統)。

圖2 群體感應抑制劑(QSIs)和LsrR、SdiA的分子對接2D圖Fig. 2 2D molecular docking of quorum sensing in hibitors (QSIs) with LsrR and SdiA

QSITU50JointeffectQSITU50JointeffectSMXPA1.16additiveVP1.10additiveFA1.08additiveMO0.85additiveBRF1.04additiveHPL1.88antagonismDP4.54antagonismDHPA1.03additiveVP1.07additiveFA1.05additiveMO1.10additiveBRF1.19additiveHPL2.07antagonismDP2.57antagonism

為了進一步驗證上述推測，我們選擇E. coli中2條群體感應系統的靶蛋白LsrB、SdiA分別和QSIs之間相互作用的結合能EbindingLsrB、EbindingSdiA值作為表征參數，與測得的毒性數據log(1/EC50)值進行回歸分析，建立的QSAR模型如下：

log(1/EC50)=0.0414EbindingLsrB-1.0071

R2=0.0268，n=7

(3)

log(1/EC50)=1.2999EbindingSdiA-17.474

R2=0.1327，n=7

(4)

如果2類QSIs作用于同一種蛋白，那么log(1/EC50)與Ebinding值之間應具有較好的相關性，但是根據式(3)、式(4)的結果，R2都小于0.2，因此證明2類QSIs作用于不同的靶蛋白。我們又對第I類QSIs與EbindingLsrB、EbindingSdiA進行了線性回歸，結果如下：

log(1/EC50)=0.1318EbindingLsrB+1.9667

R2=0.6487，n=5

(5)

log(1/EC50)=3.8828EbindingSdiA-13.327

R2=0.2624，n=5

(6)

可見，第I類QSIs與LsrR蛋白結合的Ebinding值與對應QSIs的log(1/EC50)之間線性關系較SdiA好，表明第I類QSIs作用于AI-2群體感應系統通路，結合蛋白為LsrR；而第II類QSIs則作用于AI-1群體感應系統通路，結合蛋白為SdiA。那么不同作用途徑的2類QSIs在和SMX、DH聯合作用時為什么會產生不同的聯合效應呢？

我們前期研究[18]發現，SMX和DH對費氏弧菌(發光菌)的24 h毒性作用中均有hormesis效應(劑量效應曲線如圖3)，其機理表現為低濃度的SMX和DH能夠促進費氏弧菌體內LuxR蛋白表達量增加，而高表達的LuxR蛋白能夠和信號分子結合促進熒光素酶的表達，導致發光增強，從而產生hormesis效應。而E. coli中的SdiA為LuxR的同源蛋白，我們推測低劑量的SMX和DH也能促進E. coli體內SdiA蛋白的表達。當這2種化合物與第I類QSIs共同作用時，由于此類QSIs的靶蛋白為LsrB，因此，低劑量的SMX或DH對SdiA蛋白表達的刺激作用不影響第I類QSIs作用的AI-2群體感應系統，同時SMX與DH的毒性作用通路與AI-2群體感應系統也不存在影響，因而聯合效應表現為相加。而當SMX或DH與第II類QSIs共同作用時，由于此類QSIs的靶蛋白為SdiA，因此，SdiA蛋白的過量表達會作用到AI-1群體感應系統，消耗更多的QSIs，使其毒性變小，最終導致聯合效應表現為拮抗(聯合作用機理如圖4)。

圖3 SMX、DH對費氏弧菌光值的毒性效應(24 h)Fig. 3 The toxicity (24 h) of SMX and DH to Vibrio fischeri

No.QSIsQSIssortlog(1/EC50)/(mol·L-1)EbindingLsrB/(kcal·mol-1)EbindingSdiA/(kcal·mol-1)1PA2.29±0.16-31.512-18.8642VP3FA4MO5BRFI1.24±0.10-25.921-17.9422.21±0.14-30.276-25.7121.84±0.11-22.556-17.1123.87±0.15-27.543-21.5316HPL7DPII1.87±0.09-27.313-19.1891.87±0.11-31.385-21.697

圖4 QSIs分別與SMX、DH聯合作用機制假設圖注： I-a為第I類QSIs與SMX；I-b為第I類QSIs與DH；II-a為第II類QSIs與SMX；II-b為第II類QSIs與DH。Fig. 4 Mechanistic hypothesis for joint toxicity of binary mixtures of QSIs with SMX and DHNote: QSIs of sort I with SMX (I-a)； QSIs of sort I with DH (I-b)； QSIs of sort II with SMX (II-a)； QSIs of sort II with DH (II-b).

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