不同植物葉片臭氧傷害癥狀及其生理響應機制的差異

楊寧，王效科，張玉龍，鄭飛翔,3,*，陳媛媛

1. 中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學, 北京 100049 3. 中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所, 北京 100081

在城市化過程中，綠化植物的引進在裝點城市市容、改善城市生態環境、提高市民精神生活質量方面具有重要的作用[1]。城市化的快速發展帶來了一系列的環境問題，其中之一就是機動車、發電站及工廠排放于大氣中的NOx、揮發性有機化合物(volatile organic compounds，VOC)濃度急劇升高[2-4]。NOx、VOC為對流層臭氧形成的前體物質，其在強光存在的條件下可快速反應形成臭氧(ozone，O3)。對流層臭氧具有明顯的季節分布特征，Wang等[5]對華東地區部分省份臭氧分布分析發現，大多數地區高濃度臭氧主要集中于夏季，其次為秋季，而這2個季節恰好是植物快速生長時期，因此植物正常生長勢必受到高濃度臭氧暴露的干擾，植物的潛在生態效益也因此會被削弱。已有相當一部分研究指出了臭氧對農作物產量[6-8]、森林生產力[9]、草地群落結構[10]的負面影響，這些研究對象均是生長在自然生態環境中，而生長于城市中的景觀植物由于特有的城市問題的存在(地表硬化、熱島效應)對臭氧脅迫將更加敏感[1]，因此明確景觀植物的臭氧響應機制將會有利于采取更有針對性的保護措施維持其生態效益。

就突變體而言，其內源激素對臭氧脅迫的響應(激素形成、合成途徑以及造成的相關傷害)存在差異，但是對于自然界中臭氧敏感植物，雖然臭氧暴露后會產生特定的臭氧傷害，但是否這些傷害源于不同的激素響應尚未見報道。因此本文以常用的萬壽菊(Tagetes erecta Linn.)、矮牽牛(Petunia hybrida Vilm.)及圓葉牽牛(Pharbitis purpurea (L.) Voigt)作為供試材料，研究臭氧脅迫下各種植物激素的變化規律，旨在闡述引起不同植物葉片臭氧傷害的激素差異，能夠為制定具有針對性的保護措施提供科學依據。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗地點與設計

實驗地點位于北京市昌平區馬池口鎮丈頭村(40°12`N, 116°8`E)種子站，該地氣候為典型的溫帶季風氣候，四季分明。年均氣溫及降雨量分別為11.8 ℃、550.3 mm(降雨主要集中在6到8月)[19]。

本實驗采用開頂式氣室(Open-Top Chamber，OTC)進行盆栽控制實驗。完整系統包括O3濃度控制系統、O3發生系統、鼓風系統、布氣系統、暴露室、O3濃度監測系統。暴露室由鋁合金框架及鋼化玻璃構成，O3由純O2通過O3發生器產生，之后由離心式鼓風機通過聚氯乙烯管(polyvinylchloid, PVC)鼓入暴露室，目標濃度通過玻璃轉子流量計進行調整，由O3分析儀(Model 49i，Thermo Scientific, USA)進行監測。

實驗共設3個O3水平，自然大氣(non-filter, NF)，低濃度臭氧(NF+60 ppb)以及高濃度臭氧(NF+120 ppb)。每種植物O3暴露期間的日(9-h)平均臭氧濃度如圖1所示(圖1A. 萬壽菊和圓葉牽牛；圖1B. 矮牽牛)。為避免氣室效應，暴露室按南北方向依次排開以確保一致的太陽輻射；暴露室間距為3 m，避免處理之間互相干擾。

1.2 實驗材料

本實驗以常見的景觀植物萬壽菊、矮牽牛及圓葉牽牛為供試材料。對于萬壽菊和矮牽牛，挑選規格一致(以株高為挑選標準：萬壽菊，12.8 cm，矮牽牛，7.0 cm)的幼苗移栽進行實驗，每盆一株，為避免植株死亡造成的后續測量實驗受限，每個暴露室放置萬壽菊20盆，矮牽牛15盆。圓葉牽牛種子購買于北京北林花卉科技有限公司，于2014年8月4日直接播種于開頂式氣室中。供試材料之間因其生長期的差異薰氣時間有所不同：萬壽菊及圓葉牽牛，2014年8月4日至9月28日；矮牽牛，2014年3月21日至6月5日，熏蒸期間遇雨天停止熏氣。3種植物每日熏氣時間一致，開始于早上8:30，結束于下午17:30。整個生育期內，除O3外其他條件一致，并確保其不成為植物生長的限制因子。

圖1 供試植物暴露期間的日平均臭氧濃度(A，萬壽菊、短牽牛；B，圓葉牽牛)注：NF，自然大氣；NF+60，NF+60 ppb O3；NF+120，NF+120 ppb O3。Fig. 1 Diurnal (9-h) mean O3 concentration for tested plants (A, marigold and morning glory; B, petunia) during experimentNote: NF, non-filter; NF+60, NF+60 ppb O3; NF+120, NF+120 ppb O3.

于盛花期采集每種植物葉片樣品。取樣時在各OTC中隨機選取5棵植株，采集同一位置的葉片(萬壽菊，從頂部數第二個分枝上完全展開的葉片；矮牽牛和圓葉牽牛，緊挨著處于盛花期的花朵)，用濕毛巾將葉片上的灰塵沾掉，然后包裹于鋁箔紙中并保存在液氮中，帶回實驗室進行各項生理指標測量。

1.3 指標測量

1.3.1 臭氧癥狀觀測

每日對供試植物進行觀測直到臭氧癥狀出現，然后通過相機拍攝，比較臭氧處理與對照組供試植物葉片和整株生長之間的差異。

1.3.2 氧化傷害

MDA(malonalgehyde)：硫代巴比妥酸法，具體步驟參考Feng等[20]的方法。可溶性蛋白：比較成熟的考馬斯亮藍法，以牛血清白蛋白作為標準品，具體步驟參考Bradford[21]的研究。

1.3.3 水楊酸、茉莉酸及脫落酸

參考Pan等[22]的測量方法，測量過程中由于儀器型號之間的差異，儀器參數設置過程中略有修改。1)浸提：稱取0.1000 g新鮮樣品于液氮中研成粉末，轉移至2 mL離心管中后，加入50 μL內標，隨后加入l mL混合浸提劑(異丙醇：超純水：濃鹽酸體積比為2:1:0.002)，于震蕩機(4 ℃、100 r·min-1)中震蕩30 min，隨后于每個樣品中加入1 mL二氯甲烷，于之前的震蕩條件下繼續震蕩30 min，結束之后于冷凍離心機(4 ℃，13 000 g)中離心5 min，此時出現明顯的分層現象，吸取下層液體900 μL于另一只離心管中，氮吹儀吹干后用0.1 mL甲醇溶解；2)高效液相色譜-質譜聯用儀測量(HPLC-ESI-MS/MS)：吸取50 μL浸提液進行HPLC-ESI-MS/MS分析。分析柱：反相C18柱(規格：4.6 mm×5 cm, 1.8 μm)；優化后的主要質譜條件：負離子模式，掃描模式為MRM(multiple reaction monitoring)，根據激素種類設置母離子和子離子(SA：136.6，92.8；ABA：262.8,152.6；JA：209.0,59.0)；3)流動相：2元梯度分離，通過改變流動相B的比例完成目標激素的分離(流動相A：純乙腈；流動相B：0.1%乙酸)，0～0.5 min，90%B，0.5～5 min，95%B，5～8 min，90%B穩定儀器。

1.4 數據分析

采用SPSS 16.0統計軟件中一元方差分析法對供試植物各指標進行顯著性分析，若存在顯著差異，則用LSD法進行多重比較。方差分析之前對每種供試植物各指標進行了正態分布及方差齊性檢驗，且各樣本之間相互獨立，利用Sigmaplot 11.0軟件繪圖。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 O3傷害

本實驗中，供試植物萬壽菊、矮牽牛及圓葉牽牛均在臭氧脅迫后表現出不同程度的臭氧傷害，但各種植物之間癥狀表現又不盡相同。1)萬壽菊、矮牽牛：臭氧暴露后，萬壽菊與矮牽牛表現出葉脈間黃化，且隨暴露時間延長黃化程度加劇(圖2和圖3)，意味著臭氧濃度升高致使供試植物提前衰老，且衰老程度較對照組加劇；2)圓葉牽牛：臭氧暴露嚴重影響了圓葉牽牛的出苗率，對于順利出苗的植株，其葉片葉脈間出現白色斑點，隨暴露時間延長，斑點密集形成白色斑塊，最終導致葉片干枯(圖4)。表明臭氧對植物的影響不是開始于已長出的葉片，而可能會直接改變種子的內部組分，致使出苗率受到影響，從而嚴重影響最終生產力。

圖2 萬壽菊(Tagetes erecta Linn.)單葉及植株生長對臭氧脅迫的響應Fig. 2 O3 injury to marigold (Tagetes erecta Linn.) leaves and growth of the whole plant

2.2 臭氧脅迫對供試植物的氧化傷害

2.2.1 丙二醛(MDA)

MDA是磷脂過氧化的產物，可用于判斷膜受損程度。本實驗中，低濃度臭氧處理致使植物葉片發生嚴重的膜脂過氧化(表1和圖5.A)，與對照相比，萬壽菊、矮牽牛及圓葉牽牛葉片MDA含量分別增加了50.2%、23.0%和126.1%，低濃度與高濃度臭氧處理之間葉片MDA含量沒有明顯的差異，說明低濃度臭氧足以最大程度的對植物細胞造成不可逆轉傷害。

2.2.2 可溶性蛋白(soluble protein)

臭氧暴露對3種供試植物葉片可溶性蛋白含量沒有明顯影響(表1和圖5B)，臭氧處理后的葉片可溶性蛋白含量與對照組相應植物含量一致。

圖3 矮牽牛(Petunia hybrida Vilm.)單葉及植株生長對臭氧脅迫的響應Fig. 3 O3 injury to petunia (Petunia hybrida Vilm.) leaves and growth of the whole plant

圖4 圓葉牽牛(Pharbitis purpurea (L.) Voigt)單葉及植株生長對臭氧脅迫的響應Fig. 4 O3 injury to morning glory (Pharbitis purpurea (L.) Voigt) leaves and growth of the whole plant

萬壽菊TageteserectaLinn.矮牽牛PetuniahybridaVilm.圓葉牽牛Pharbitispurpurea(L.)Voigt丙二醛(malonalgehyde,MDA)********可溶性蛋白(Solubleprotein)nsnsns脫落酸(Abscisicacid,ABA)***nsns水楊酸(Salicylicacid,SA)ns*****茉莉酸(Jasmonicacid,JA)***-***水楊酸/茉莉酸(SA/JA)**-***

注: ns表示臭氧處理與對照之間無顯著差異；*表示臭氧處理與對照之間具有顯著差異(**P≤0.01;***P≤0.001)。

Note: ns stands for significant difference between O3treatment and control;**P≤0.01,***P≤0.001, significant difference between O3treatment and control.

圖5 臭氧脅迫對萬壽菊1(Tagetes erecta Linn.)、矮牽牛2(Petunia hybrida Vilm.)及圓葉牽牛3(Pharbitis purpurea (L.) Voigt)葉片膜脂過氧化(A)及可溶性蛋白含量(B)的影響Fig. 5 O3 effect on plasmalemma lipid peroxidation (MDA, A) and soluble protein (B) of marigold 1 (Tagetes erecta Linn.), petunia 2 (Petunia hybrida Vilm.) and morning glory 3 (Pharbitis purpurea (L.) Voigt)

圖6 臭氧脅迫對萬壽菊1(Tagetes erecta Linn.)、矮牽牛2(Petunia hybrida Vilm.)及圓葉牽牛3(Pharbitis purpurea (L.) Voigt)葉片激素含量的影響Fig. 1 O3 effect on salicylic acid (SA, A), jasmonic acid (JA, B) and abscisic acid (ABA, C) of marigold 1 (Tagetes erecta Linn.), petunia 2 (Petunia hybrida Vilm.) and morning glory 3 (Pharbitis purpurea (L.) Voigt)

2.3 供試植物激素對臭氧脅迫的響應

臭氧暴露對萬壽菊葉片水楊酸的代謝沒有明顯影響(表1和圖6A)，但是顯著抑制了茉莉酸的合成(圖6B)，與對照相比其含量降低了78.8%～80.5%。高濃度臭氧顯著增加了萬壽菊葉片脫落酸含量，比對照增加了154.0%(圖6C)。

臭氧暴露刺激了矮牽牛葉片水楊酸合成，與對照相比低濃度與高濃度處理下葉片水楊酸含量分別增加了111.5%和94.6%，臭氧處理之間其含量沒有差異(圖6A)；矮牽牛葉片茉莉酸含量較少，在本實驗中用Pan等[22]的方法未檢測出(圖6B)；葉片脫落酸含量對臭氧脅迫響應不敏感，其含量與對照相比沒有明顯變化(圖6.C)。

高濃度臭氧暴露促進了圓葉牽牛葉片水楊酸的累積(圖6A)，與對照相比其含量增加了62.5%；茉莉酸對臭氧脅迫的響應與水楊酸呈相反的趨勢，即臭氧濃度升高不利于茉莉酸在葉片的累積，即使是低濃度處理，其含量較對照也降低了28.9%，隨臭氧濃度增加，降低幅度增大(83.9%)(圖6B)；脫落酸對臭氧脅迫響應不敏感，臭氧熏蒸后，其濃度沒有明顯變化(圖6C)。

高濃度臭氧暴露擾亂了萬壽菊與圓葉牽牛葉片的激素平衡，致使SA/JA比值增加，與對照相比分別增加了720%和1300%，低濃度臭氧處理后SA/JA亦表現出增加的趨勢(圖7)。

圖7 萬壽菊1(Tagetes erecta Linn.)、矮牽牛2(Petunia hybrida Vilm.)及圓葉牽牛3(Pharbitis purpurea (L.) Voigt)葉片激素穩態對臭氧脅迫的響應Fig. 7 O3 effect on the ratio of salicylic acid to jasmonic acid (SA/JA) of marigold 1 (Tagetes erecta Linn.), petunia 2 (Petunia hybrida Vilm.) and morning glory 3 (Pharbitis purpurea (L.) Voigt)

3 討論(Discussion)

萬壽菊、矮牽牛和圓葉牽牛作為常用的城市景觀植物已廣泛存在于市民的日常生活中。本實驗中，供試植物對臭氧脅迫的響應表現不一致，但都產生了不可逆轉的臭氧傷害：臭氧處理后萬壽菊和矮牽牛葉脈間出現黃化，且最初癥狀分別發生在NF+120處理暴露后的第5 天和第21 天，對應的臭氧累積值AOT40分別為6.4和17.3 ppm·h，隨暴露時間的延長黃化程度加劇；逐漸升高的臭氧濃度顯著地抑制了圓葉牽牛的出苗率，播種18 d時出苗的植株已全部長出真葉，但同時也伴隨著真葉臭氧傷害的形成(此時NF+60處理后臭氧累積值，AOT40為15.4 ppm·h)：葉脈間產生白色斑點，隨暴露時間的延長和臭氧濃度的升高，白色斑點擴大形成白色斑塊，完全覆蓋2條葉脈之間的空間，最終可以看到出現白色癥狀的地方顏色變暗、干枯。局部傷害的形成最終致使植物的整體長勢受到影響。所以就可視傷害而言，3種供試植物對臭氧都比較敏感，可作為臭氧指示植物初步了解城市的臭氧污染情況。

植物表觀臭氧傷害特征的形成源于其內在生理發生的變化[23]。臭氧通過氣孔進入葉片后，一部分可被酶類與非酶類的抗氧化物質降解[24-25]，剩余部分則退化形成氧化能力較強的活性氧，與細胞膜上不飽和脂肪酸雙鍵反應，觸發脂質過氧化，進一步引起膜結構及功能的變化[26]。MDA是脂質過氧化的終端產物，是評估細胞膜脂過氧化程度的成熟指標[27]，其含量高低間接反映了細胞損傷的程度。本實驗中臭氧處理加劇了供試植物的膜脂過氧化程度，意味著植物細胞發生了嚴重的氧爆反應，活性氧的形成顯然超過了細胞組分的自我清除能力[28]，激活了額外的ROS合成[29]，與膜脂過氧化形成正反饋循環，加速細胞傷害的形成。臭氧誘發產生氧化傷害后，植物細胞會自發啟動一系列抗氧化防御機制減弱臭氧傷害[30]。植物體內可溶性蛋白質扮演的重要角色是作為酶類參與細胞代謝，其具有很強的持水力，可為細胞抵御外界脅迫提供良好的生理基礎[31]。本實驗中3種供試植物葉片可溶性蛋白對臭氧響應不敏感，臭氧脅迫后期其含量沒有明顯變化，意味著該時期供試植物臭氧傷害的形成并非源于蛋白質抵御臭氧脅迫能力的下降。

水楊酸、茉莉酸以及脫落酸是植物體內三大激素，是調節植物生長發育的痕量信號分子，它們可單獨或共同調節植物代謝。明確臭氧脅迫下各激素變化規律可為植物提前預防臭氧傷害提供科學依據。前人研究發現，SA、ABA可刺激產生ROS，因此被認為是負面調節劑[14, 16]，而JA可以延緩甚至遏制細胞病變及死亡的蔓延，因此被認為是正面調節劑[12, 17, 32]。本實驗中，不同供試植物對臭氧脅迫的激素響應有所差異：臭氧濃度升高降低了萬壽菊葉片茉莉酸含量，這與之前在農作物和森林樹種上的研究結果不同，Ren等[33]和Koch等[34]指出植物細胞為了限制ROS傷害，會刺激JA的合成，造成此種差異的原因可能是臭氧促進了萬壽菊葉綠體解體(數據未列出)，導致JA合成場所減少[17]。臭氧處理后水楊酸含量沒有明顯的變化，說明萬壽菊臭氧傷害的形成主要源于JA對植物的保護能力降低，而非直接的由于臭氧誘導的SA傷害能力的增強。矮牽牛葉片激素對臭氧脅迫的響應與萬壽菊不同，臭氧暴露后增加了矮牽牛葉片SA含量，JA含量太少，無論是對照組還是處理組，用Pan等[22]的方法均未檢測出，ABA含量對臭氧脅迫不敏感，說明臭氧對矮牽牛造成的脅迫是由于SA累積的直接傷害引起的。Jaiwal等[35]曾指出，臭氧敏感的植物體內會累積大量的SA，而SA的大量合成，會引起質外體活性氧的大量產生[36]。高濃度臭氧處理圓葉牽牛后，其葉片SA含量顯著上升，JA含量顯著降低，意味著該植物SA累積的直接傷害加強，同時JA的保護能力降低，兩者共同導致其臭氧傷害的形成。各類激素之間若能相互配合調節ROS產生與細胞處理ROS之間的平衡，則植物形成的臭氧傷害的蔓延會得到一定程度的遏制[12]，所以植物體內的激素平衡對維持植物生長發育水平有重要的作用[37]。本實驗中，高濃度臭氧暴露使萬壽菊和圓葉牽牛葉片SA與JA的比值增加，意味著植物體內的激素平衡被打亂，JA對SA拮抗作用的能力降低，JA已不足以保護植物免遭臭氧誘導的SA累積傷害。

因此，在臭氧濃度尚得不到有效控制的情況下，明確不同植物臭氧傷害形成的激素響應，可有效采取針對性保護措施最大程度地維持其生態效益。

致謝：感謝國家自然科學基金(No. 31200295)對本研究的資助。

[1] Pellegrini E. PSII photochemistry is the primary target of oxidative stress imposed by ozone in Tilia americana [J]. Urban Forestry and Urban Greening, 2014, 13(1): 94-102

[2] Huang J, Zhou C, Lee X, et al. The effects of rapid urbanization on the levels in tropospheric nitrogen dioxide and ozone over East China [J]. Atmospheric Environment, 2013, 77: 558-567

[3] 黃偉, 余家燕, 鮑雷, 等. 重慶市交通道路氮氧化物排放簡析[J]. 環境科學導刊, 2015, 34(2): 131-134

Huang W, Yu J Y, Bao L, et al. Investigation of characteristics of nitrogen oxides emission from road in Chongqing City [J]. Environmental Science Survey, 2015, 34(2): 131-134

[4] 李茜, 宋金平, 張建輝, 等. 中國城市化對環境空氣質量影響的演化規律研究[J]. 環境科學學報, 2013, 33(9): 2402-2411

Li Q, Song J P, Zhang J H, et al. Dynamics in the effect of China's urbanization on air quality [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013, 33(9): 2402-2411 (in Chinese)

[5] Wang X, Manning W, Feng Z, et al. Ground-level ozone in China: Distribution and effects on crop yields [J]. Environmental Pollution, 2007, 147(2): 394-400

[6] Avnery S, Mauzerall D L, Liu J, et al. Global crop yield reductions due to surface ozone exposure: 2. Year 2030 potential crop production losses and economic damage under two scenarios of O3pollution [J]. Atmospheric Environment, 2011, 45(13): 2297-2309

[7] Chuwah C, van Noije T, van Vuuren D P, et al. Global impacts of surface ozone changes on crop yields and land use [J]. Atmospheric Environment, 2015, 106: 11-23

[8] Ghude S D, Jena C, Chate D, et al. Reductions in India's crop yield due to ozone [J]. Geophysical Research Letters, 2014, 41(15): 5685-5691

[9] Proietti C, Anav A, De Marco A, et al. A multi-sites analysis on the ozone effects on gross primary production of European forests [J]. Science of The Total Environment, 2016, 556: 1-11

[10] Gilliland N, Chappelka A, Muntifering R, et al. Changes in southern Piedmont grassland community structure and nutritive quality with future climate scenarios of elevated tropospheric ozone and altered rainfall patterns [J]. Plant Biology, 2016, 18(S1): 47-55

[11] Jyothsna P, Murthy S D S. A review on effect of senescence in plants and role of phytohormones in delaying senescence [J]. International of Plant, Animal and Environmental Sciences, 2016, 6(1): 152-161

[12] Overmyer K, Brosché M, Kangasj?rvi J. Reactive oxygen species and hormonal control of cell death [J]. Trends in Plant Science, 2003, 8(7): 335-342

[13] 趙天宏, 劉波, 王巖, 等. 臭氧脅迫對大豆根系激素含量和活性氧代謝的影響[J]. 干旱地區農業研究, 2013, 31(4): 119-123

Zhao T, Liu B, Wang Y, et al. Effects of ozone stress on soybean roots endogenous hormones and reactive oxygen metabolism [J]. Agricultural Research in the Arid Areas, 2013, 31(4): 119-123 (in Chinese).

[14] Rao M V, Lee H-i, Creelman R A, et al. Jasmonic acid signaling modulates ozone-induced hypersensitive cell death [J]. The Plant Cell, 2000, 12(9): 1633-1646

[15] Miura K, Okamoto H, Okuma E, et al. SIZ1 deficiency causes reduced stomatal aperture and enhanced drought tolerance via controlling salicylic acid-induced accumulation of reactive oxygen species in Arabidopsis [J]. The Plant Journal, 2013, 73(1): 91-104

[16] Pellegrini E, Trivellini A, Campanella A, et al. Signaling molecules and cell death in Melissa officinalis plants exposed to ozone [J]. Plant Cell Reports, 2013, 32(12): 1965-1980

[17] Bartoli C G, Casalongué C A, Simontacchi M, et al. Interactions between hormone and redox signalling pathways in the control of growth and cross tolerance to stress [J]. Environmental and Experimental Botany, 2013, 94: 73-88

[18] Overmyer K, Tuominen H, Kettunen R, et al. Ozone-sensitive Arabidopsis RCD1 mutant reveals opposite roles for ethylene and jasmonate signaling pathways in regulating superoxide-dependent cell death [J]. The Plant Cell, 2000, 12(10): 1849-1862

[19] 佟磊, 馮宗煒, 蘇德·畢力格, 等. 冬小麥氣孔臭氧通量擬合及通量產量關系的比較分析[J]. 生態學報, 2012, 32(9): 2890-2899

Tong L, Feng Z W, Sudebilige, et al. Stomatal ozone uptake modeling and comparative analysis of flux-response relationships of winter wheat [J]. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(9): 2890-2899 (in Chinese)

[20] Feng Z, Pang J, Kobayashi K, et al. Differential responses in two varieties of winter wheat to elevated ozone concentration under fully open-air field conditions [J]. Global Change Biology, 2011, 17(1): 580-591

[21] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1-2): 248-254

[22] Pan X, Welti R, Wang X, et al. Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry [J]. Nature Protocols, 2010, 5(6): 986-992

[23] 張巍巍, 鄭飛翔, 王效科, 等. 臭氧對水稻根系活力、可溶性蛋白含量與抗氧化系統的影響[J]. 植物生態學報, 2009, 33(3): 425-432

Zhang W, Zheng F, Wang X, et al. Effects of ozone on root activity, soluble protein content and antioxidant system in Oryza sativa roots [J]. Chinese Journal of Plant Ecology, 2009, 33(3): 425-432 (in Chinese)

[24] Booker F L, Burkey K O, Jones A M. et al. Re-evaluating the role of ascorbic acid and phenolic glycosides in ozone scavenging in the leaf apoplast of Arabidopsis thaliana L [J]. Plant, Cell and Environment, 2012, 35(8): 1456-1466

[25] Conklin P, Barth C. Ascorbic acid, a familiar small molecule intertwined in the response of plants to ozone, pathogens, and the onset of senescence [J]. Plant, Cell and Environment, 2004, 27(8): 959-970

[26] Urbach W, Schmidt W, Kolbowski J, et al. Wirkung von Umweltschadstoffen auf Photosynthese und Zellmembranen von Pflanzen. In: 1. Status seminar der PBWU zum Forschungsschwerpunkt "Waldschii-den" GSF Bericht 6/89 [M]. Neuherberg: GSF, 1989: 195-206

[27] Ranieri A, D'Urso G, Nali C, et al. Ozone stimulates apoplastic antioxidant systems in pumpkin leaves [J]. Physiologia Plantarum, 1996, 97(2): 381-387

[28] Singh A A, Agrawal S, Shahi J, et al. Investigating the response of tropical maize (Zea mays L.) cultivars against elevated levels of O3at two developmental stages [J]. Ecotoxicology, 2014, 23(8): 1447-1463

[29] Sawada H, Komatsu S, Nanjo Y, et al. Proteomic analysis of rice response involved in reduction of grain yield under elevated ozone stress [J]. Environmental and Experimental Botany, 2012, 77: 108-116

[30] Ahsan N, Nanjo Y, Sawada H, et al. Ozone stress-induced proteomic changes in leaf total soluble and chloroplast proteins of soybean reveal that carbon allocation is involved in adaptation in the early developmental stage [J]. Proteomics, 2010, 10(14): 2605-2619

[31] 張鵬, 曾祥國, 韓永超, 等. 草莓‘晶瑤’感染炭疽病后抗性生理指標分析[J]. 中國農學通報, 2014, 30(13): 161-167

Zhang P, Zeng X G, Han Y C, et al. Study on physiological factors in strawberry 'Jingyao' inoculated with anthracnose [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014, 30(13): 161-167 (in Chinese)

[32] Whitacre D M. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology [M]. Springer, 2011: 61-111

[33] Ren Q, Sun Y, Guo H, et al. Elevated ozone induces jasmonic acid defense of tomato plants and reduces midgut proteinase activity in Helicoverpa armigera [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 2015, 154(3): 188-198

[34] Koch J R, Creelman R A, Eshita S M, et al. Ozone sensitivity in hybrid poplar correlates with insensitivity to both salicylic acid and jasmonic acid. The role of programmed cell death in lesion formation [J]. Plant Physiology, 2000, 123(2): 487-496

[35] Jaiwal P K, Singh R P, Dhankher O P. Genetic Manipulation in Plants for Mitigation of Climate Change [M]. Springer, 2015: 1-14

[36] Xu E, Brosché M. Salicylic acid signaling inhibits apoplastic reactive oxygen species signaling [J]. BioMed Central Plant Biology, 2014, 14(1): 155-171

[37] 鄭莎莎, 孫傳范, 孫紅春, 等. 不同外源激素對花鈴期棉花主莖葉生理特性的影響[J]. 中國農業科學, 2009, 42(12): 4383-4389

Zheng S S, Sun C F, Sun H C, et al. Effects of different exogenous hormones on physiological characteristics of main stem leaves at flower and boll stage in cotton [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(12): 4383-4389 (in Chinese)