3種酰胺類除草劑對斑馬魚不同生長階段的急性毒性效應

程艷紅，葛婧，胡高潔，蔡磊明，陳列忠，蔣金花

浙江省農業科學院農產品質量標準研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室，農業部農藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

酰胺類除草劑是一類高效、高選擇性的除草劑。自美國Monsanto公司于1956年成功開發此類除草劑以來，酰胺類除草劑發展迅速，產量逐年增長，在各類除草劑中列第4位，僅排在氨基酸類、磺酰脲類和其他結構類之后[1-2]。酰胺類除草劑包括甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺等，其中乙草胺和丁草胺已逐步成為我國用量最大的三大除草劑中的2種，年產量都為萬噸以上，且呈繼續增長的趨勢[3]。在保障農業安全和提高品質產量的同時，酰胺類除草劑在環境中的殘留量也逐年增加，是農田和水源中的污染物，通過雨水淋溶、地表徑流、食物鏈富集等作用，對生態系統和人類健康產生潛在風險。早在1994年U.S. EPA (Environmental Protection Agency)將乙草胺定為B-2類致癌物。針對目前國內酰胺類除草劑的生產和使用現狀，國家環保部頒布了《酰胺類農藥工業水污染物排放標準》的征求意見稿[4]。諸多研究表明，酰胺類除草劑具有內分泌干擾效應和“三致”效應，如可以干擾蝌蚪、非洲爪蟾和稀有鮈鯽體內甲狀腺激素的表達和合成[5-8]，可使斑馬魚胚胎發育遲緩和畸變，并且干擾早期生活階段斑馬魚的內分泌系統和生長發育，具有一定的生殖毒性[9-12]。

目前，國內對這類農藥的環境安全性評價主要集中在農藥的濃度檢測以及農藥對生物個體某個生長階段水平的急性毒性、對酶(靶標酶、代謝酶)活性的改變及對遺傳物質損傷的研究，缺少對生物體整個生長階段的毒性影響以及環境安全評價方法。

斑馬魚在毒理學研究中應用廣泛，對水質污染與毒性物質反應靈敏，其基因與人類基因同源性在87%以上，且具有繁殖周期短，胚胎透明，個體小，易于養殖，易于觀察藥物對活體胚胎內各個組織和器官等特點，已成為各種研究的最佳模式生物。本研究以斑馬魚為受試對象，研究乙草胺、丙草胺和丁草胺3種酰胺類除草劑對斑馬魚不同生長階段的毒性差異以更好地評價該類除草劑的毒性效應，闡明致毒機理，最終為酰胺類除草劑的毒性預測和生態風險評價提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：24孔細胞培養板和6孔細胞培養板均購自浙江拱東醫療科技有限公司，分別作為胚胎和仔魚染毒器具。

試劑：乙草胺原藥(93.0%)，山東僑昌化學有限公司，丙草胺原藥(96.8%)、丁草胺(92.5%)，杭州慶豐化工有限公司；分析純吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為天津市福晨化學試劑廠。

1.2 實驗材料

斑馬魚(Danio rerio)種魚購自武漢中國科學院水生生物研究所的國家斑馬魚資源中心，AB型品系，本試驗所用斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚均為種魚繁殖所得。斑馬魚胚胎分別為同一天收集的健康胚胎；仔魚為孵化后8日齡；幼魚為孵化后55日齡；成魚為3月齡。仔魚、幼魚和成魚均于正式試驗前24 h停止喂食。

試驗用水為曝氣除氯并經活性炭過濾的自來水，水溫為(25±1) ℃，pH控制在6.5～7.5，光/暗比為14 h/10 h，溶解氧≥5.8 mg·L-1。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗藥液配制

乙草胺、丙草胺、丁草胺原藥用吐溫-80和DMF溶解，經超聲混勻定容后配制成一定濃度的標準儲備液，冷藏備用。試驗時，用移液器吸取適量儲備液加入一定量的標準稀釋水，超聲混勻，按相應倍數逐級稀釋至設計濃度。試驗期間，各試驗容器內的助溶劑DMF在水中的最終濃度均低于0.1 mg·L-1。標準稀釋水按照《化學品魚類急性毒性試驗》[13]方法配制。

1.3.2 胚胎染毒試驗

參考世界經濟合作與發展組織(OECD)方法[14]，通過立體顯微鏡觀察，挑選發育正常的健康受精卵供試。采用24孔細胞培養板，每孔加入2 mL供試藥液并放入1枚受精卵。根據預備試驗結果，設定乙草胺、丙草胺、丁草胺對斑馬魚胚胎毒性試驗濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設置助劑對照組，以稀釋水為空白對照組。每濃度設3次重復，每重復為1個24孔板。

染毒期間環境溫度為(25±1) ℃，光/暗比為14 h/10 h。每24 h更換1次溶液。試驗期間分別于染毒6、24、48、72、96 h觀察并記錄死亡數、孵化數及相關中毒癥狀，并及時取出死亡個體。

1.3.3 仔魚、幼魚和成魚試驗

參考OECD TG 203[15]方法，設計乙草胺、丙草胺、丁草胺對不同生長階段斑馬魚的急性毒性試驗。試驗用水為曝氣除氯并經活性炭過濾的自來水。根據預備試驗結果，設定斑馬魚仔魚、幼魚和成魚的試驗濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設助劑對照組，以曝氣自來水為空白對照組。

仔魚急性毒性試驗采用6孔板，每孔放入3條仔魚，設2次重復，每重復為1個6孔板；幼魚和成魚采用6 L魚缸，每缸15條魚，均設2次重復。仔魚、幼魚和成魚的試驗過程均采用“半靜態法”，每24 h更換1次藥液。

試驗期間分別于6、24、48、72和96 h時間點觀察并記錄各組斑馬魚中毒癥狀及死亡情況，每隔24 h檢查各組的pH值及溶解氧含量，并及時清除死魚。

1.4 數據處理

用DPS數據處理系統9.50標準版計算斑馬魚

胚胎、仔魚、幼魚和成魚的LC50值及其95%置信區間，分析乙草胺、丙草胺和丁草胺對斑馬魚各生長階段的毒性差異。

2 結果(Results)

2.1 乙草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性效應

圖1為斑馬魚胚胎經不同濃度乙草胺處理不同時間后的死亡率。不同處理組在24 h和48 h都未出現死亡，72 h時，12.0、8.00、5.33、3.56 mg·L-1乙草胺處理組的胚胎死亡率急速上升，96 h時死亡率分別為100%、62.5%、15.0%、5.00%。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的死亡率沒有影響。

圖1 乙草胺對斑馬魚胚胎暴露24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率的影響Fig. 1 Effect of acetochlor on mortality rate of zebrafish embryo for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h

農藥Pesticide生長階段Lifestages試驗濃度/(mg·L-1)Concentrations/(mg·L-1)乙草胺Acetochlor胚胎Embryo12.08.005.333.562.37仔魚Larvae3.112.071.380.9220.614幼魚Juvenile3.603.002.502.081.74成魚Adult2.001.541.180.9100.700丙草胺Pretilachlor胚胎Embryo4.623.552.732.101.62仔魚Larvae3.002.502.081.741.451.21幼魚Juvenile3.002.502.081.741.45成魚Adult3.002.502.081.741.45丁草胺Butachlor胚胎Embryo3.912.441.530.9540.596仔魚Larvae3.131.951.220.7630.477幼魚Juvenile4.003.332.782.311.93成魚Adult1.671.391.160.9650.804

圖2 乙草胺對斑馬魚胚胎暴露24 h、48 h、72 h和96 h孵化率的影響Fig. 2 Effect of acetochlor on the hatching rate of zebrafish embryo for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h

圖2為不同濃度乙草胺處理后對斑馬魚胚胎孵化的影響。研究發現，低濃度的乙草胺對斑馬魚的胚胎孵化沒有影響，高濃度的乙草胺對胚胎的孵化有一定的抑制作用。染毒72 h和96 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組2.37、3.56、5.33、8.00、12.0 mg·L-1乙草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為93.8%、93.8%、93.8%、51.3%、22.5%、18.8%、0%和

98.8%、97.5%、96.3%、96.3%、86.3%、66.3%、0%。

表2為96 h 時乙草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的半致死濃度(LC50)及95%置信區間。從中可看出，乙草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為5.82、1.34、3.00、1.44 mg·L-1，因此，乙草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性從高到低順序依次為：仔魚>成魚>幼魚>胚胎。

圖3 丙草胺對斑馬魚胚胎暴露24 h、48 h、72 h和96 h死亡率的影響Fig. 3 Effect of pretilachlor on mortality rate of zebrafish embryo for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h

生長階段Lifestages暴露時間/hExposureduration/h毒力回歸方程Toxicregressionequation相關系數Relativecoefficient半致死濃度(95%置信限)/(mg·L-1)LC50(95%CI)/(mg·L-1)胚胎Embryo24---48---72Y=0.624+5.00x0.81513.3(5.58～31.6)96Y=4.54+12.5x0.9565.82(4.76～7.11)仔魚Larvae24Y=1.45+9.78x0.9712.31(1.86～2.87)48Y=2.80+9.09x0.9641.75(1.44～2.12)72Y=3.19+12.8x0.9761.39(1.20～1.60)96Y=3.34+12.9x0.9781.34(1.17～1.54)幼魚Juvenile24Y=4.42+15.0x0.8864.26(3.00～6.05)48Y=4.10+16.3x0.9203.60(2.91～4.47)72Y=5.36+20.9x0.9423.13(2.73～3.60)96Y=6.12+23.3x0.9623.00(2.71～3.32)成魚Adult24Y=0.804+11.1x0.8932.39(1.52～3.76)48Y=2.52+9.25x0.8791.85(1.29～2.66)72Y=2.87+10.9x0.8841.57(1.19～2.07)96Y=3.02+12.4x0.9211.44(1.19～1.75)

2.2 丙草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性效應

圖3為斑馬魚胚胎經不同濃度丙草胺處理不同時間后的死亡率。不同處理組在24 h和48 h內都未出現死亡，在72～96 h內，隨著暴露時間的延長，丙草胺各濃度處理組的胚胎死亡率逐漸增加，在96 h時，1.62、2.10、2.73、3.55和4.62 mg·L-1試驗組的死亡率分別為0%、20.0%、25.0%、72.5%和100%。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的死亡率沒有影響。

圖4為不同濃度丙草胺處理后對斑馬魚胚胎孵化的影響。研究發現，隨著暴露濃度的增加，丙草胺各濃度處理組對斑馬魚胚胎孵化的抑制作用逐漸增加。染毒96 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組1.62、2.10、2.73、3.55和4.62 mg·L-1丙草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為100%、100%、97.5%、66.3%、37.5%、0%、0%。

表3為96 h 時丙草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的半致死濃度(LC50)及95%置信區間。從中可看出，丙草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為2.79、2.02、2.26、2.01 mg·L-1，丙草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的急性毒性順序為：仔魚、成魚>幼魚>胚胎。

2.3 丁草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性效應

圖5為斑馬魚胚胎經不同濃度丁草胺處理不同時間后的死亡率。在24～96 h內，隨著暴露時間的延長，丁草胺各濃度處理組的胚胎死亡率逐漸增加，在96 h時，0.596、0.954、1.53、2.44和3.91 mg·L-1試驗組的死亡率分別為0%、12.5%、15.0%、30.0%和100%。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的死亡率沒有影響。

圖4 丙草胺對斑馬魚胚胎暴露24 h、48 h、72 h和96 h孵化率的影響Fig. 4 Effect of pretilachlor on the hatching rate of zebrafish embryo for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h

生長階段Lifestages暴露時間/hExposuretime/h毒力回歸方程Toxicregressionequation相關系數Relativecoefficient半致死濃度(95%置信限)/(mg·L-1)LC50(95%CI)/(mg·L-1)胚胎Embryo24---48---72Y=0.000800+18.8x0.7255.17(2.34～11.4)96Y=3.41+18.8x0.9462.79(2.42～3.23)仔魚Larvae24---48Y=2.35+14.1x0.8413.32(2.22～4.96)72Y=1.29+20.5x0.9272.03(1.79～2.30)96Y=1.28+20.5x0.9292.02(1.79～2.29)幼魚Juvenile24---48Y=2.79+11.6x0.7094.69(1.80～12.2)72Y=7.30+32.8x0.8942.37(2.01～2.79)96Y=6.58+32.8x0.9662.26(2.08～2.45)成魚Adult24---48Y=2.79+11.6x0.7094.69(1.80～12.2)72Y=7.18+32.1x0.8892.40(2.02～2.84)96Y=5.19+33.6x0.9582.01(1.84～2.19)

圖5 丁草胺對斑馬魚胚胎暴露24 h、48 h、72 h和96 h死亡率的影響Fig. 5 Effect of butachlor on mortality rate of zebrafish embryo for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h

圖6為不同濃度丁草胺處理后對斑馬魚胚胎孵化的影響。研究表明，染毒48 h后，助劑對照、空白對照組的胚胎都未孵化，不同濃度的丁草胺對斑馬魚胚胎孵化有一定程度的促進作用，0.596、0.954、1.53、2.44 mg·L-1丁草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為5.00%、11.3%、7.50%、5.00%。隨著暴露時間的增加，丁草胺各濃度處理組對斑馬魚胚胎的孵化具有不同程度的抑制作用。染毒72 h和96 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組0.596、0.954、1.53、

2.44和3.91 mg·L-1丁草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為88.8%、91.3%、90.0%、73.8%、63.8%、42.5%、0%和98.8%、100%、97.5%、86.3%、83.8%、86.3%、0%。

表4為96 h 時丁草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的半致死濃度(LC50)及95%置信區間。從中可看出，丁草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為1.73、0.919、3.37、1.19 mg·L-1，因此，丁草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性從高到低順序依次為：仔魚>成魚>胚胎>幼魚。

圖6 丁草胺對斑馬魚胚胎暴露24 h、48 h、72 h和96 h孵化率的影響Fig. 6 Effect of butachlor on hatching rate of zebrafish embryo for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h

生長階段Lifestages暴露時間/hExposuretime/h毒力回歸方程Toxicregressionequation相關系數Relativecoefficient半致死濃度(95%置信限)/(mg·L-1)LC50(95%CI)/(mg·L-1)胚胎Embryo24Y=2.14+3.19x0.6747.90(0.878～71.0)48Y=2.39+4.10x0.7454.34(1.23～15.2)72Y=2.41+4.65x0.8003.60(1.43～9.03)96Y=2.60+10.1x0.9121.73(1.22～2.44)仔魚Larvae24Y=1.85+6.89x0.9552.87(1.96～4.20)48Y=4.04+10.8x0.9671.27(1.01～1.50)72Y=4.24+10.9x0.9691.18(0.969～1.43)96Y=5.28+7.55x0.9520.919(0.706～1.20)幼魚Juvenile24Y=5.70+16.8x0.8784.34(3.16～5.97)48Y=5.28+18.0x0.9103.73(3.05～4.57)72Y=6.12+20.4x0.9363.50(3.02～4.06)96Y=6.65+22.1x0.9413.37(2.96～3.84)成魚Adult24Y=0.720+18.3x0.8831.71(1.29～2.27)48Y=2.70+14.8x0.8731.43(1.16～1.77)72Y=2.77+15.9x0.8911.38(1.15～1.65)96Y=4.39+8.19x0.9651.19(1.10～1.29)

3 討論(Discussion)

隨著人們對環境安全意識的提高，農藥對環境和非靶標生物的安全性也得到了廣泛關注。魚類為重要的、典型的非靶標生物，是水生生態系統中非常重要組成部分，是自然生態系統中重要的生物類群和寶貴的自然資源，對周圍環境變化的響應也比較敏感。斑馬魚已成為包括OECD、ISO、U.S. EPA等國際組織機構推薦使用的標準模式魚種之一，其整個生命周期的各個階段均可以用來開展相關研究。本試驗分別以斑馬魚胚胎、8日齡仔魚、55日齡幼魚和3月齡成魚為研究對象，研究了乙草胺、丙草胺和丁草胺對斑馬魚不同生長階段的急性毒性試驗。急性毒性試驗試驗時間短、測定方法簡單和試驗結果可以提供農藥的毒性級別等信息，為農藥登記和管理提供參考。

斑馬魚胚胎毒性試驗具有許多優勢，如胚胎試驗只需要極少量受試藥品；胚胎試驗能夠更好地反映化合物的致畸效應；更能順應發展的動物福利要求。斑馬魚的胚胎是評價環境污染物發育毒性和致畸效應的模式生物，可以在卵受精后開始實驗。研究表明，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺5種酰胺類除草劑均能抑制斑馬魚胚胎的孵化并誘導斑馬魚胚胎出現心包囊水腫、游囊關閉、軀干彎曲等癥狀[16]，而且，乙草胺能干擾斑馬魚甲狀腺相關基因的表達，具有一定的甲狀腺內分泌干擾作用[17]。

本研究中，斑馬魚胚胎染毒72 h和96 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組2.37、3.56、5.33、8.00、12.0 mg·L-1乙草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為93.8%、93.8%、93.8%、51.3%、22.5%、18.8%、0%和98.8%、97.5%、96.3%、96.3%、86.3%、66.3%、0%。染毒96 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組1.62、2.10、2.73、3.55和4.62 mg·L-1丙草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為100%、100%、97.5%、66.3%、37.5%、0%、0%。染毒72 h和96 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組0.596、0.954、1.53、2.44和3.91 mg·L-1丁草胺對斑馬魚胚胎的孵化率分別為88.8%、91.3%、90.0%、73.8%、63.8%、42.5%、0%和98.8%、100%、97.5%、86.3%、83.8%、86.3%、0%。乙草胺、丙草胺和丁草胺高濃度處理組均抑制斑馬魚胚胎的孵化。有研究認為造成胚胎發育遲緩的原因可能與超氧化物歧化酶SOD 和腺苷三磷酸ATPase的活性抑制有關，在受精卵通過分裂分化產生機體全部細胞表型的過程中，氧作為關鍵的環境因子起著重要作用，沒有氧的參與胚胎不能正常地生長發育。當SOD活性受到抑制時，正常的活性氧平衡被打破，從而影響胚胎的正常發育。而ATPase的作用是水解高能化合物ATP而釋放供生命活動所需的能量，它對胚胎發育的影響是顯而易見的[18]。

死亡率通常可以作為一個重要的生態毒理學指標，用以評價污染物的毒性大小。斑馬魚96 h急性毒性試驗一般被用作評價農藥對魚類等水生脊椎動物可能存在風險的常規方法。本研究發現，酰胺類除草劑對斑馬魚不同生長階段的毒性隨處理濃度的增大而增加，同時隨暴露時間的延長而增加，顯示一定的劑量-效應和時間-效應關系。乙草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性從高到低順序依次為：仔魚>成魚>幼魚>胚胎，丙草胺對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的急性毒性順序為：仔魚、成魚>幼魚>胚胎，丁草胺對斑馬魚不同生長階段的毒性從高到低順序依次為：仔魚>成魚>胚胎>幼魚。可見，仔魚階段對酰胺類除草劑最敏感，成魚其次，幼魚和胚胎階段的毒性效應最小，酰胺類除草劑對斑馬魚4個典型生長階段的毒性差異較大，這可能與斑馬魚不同生長階段的個體的生長發育密切相關。魚類的早期生命階段如胚胎和仔魚階段對化學物質的敏感性要高于成年及幼魚階段，因為斑馬魚在胚胎和仔魚階段不具備像成年及幼魚個體那樣的代謝解毒能力。另外胚胎的外膜能夠起到阻礙有毒化合物與生命體接觸的作用，具有一定的保護作用，使得斑馬魚胚胎對化學物質具有一定的耐受能力。從本研究的結果來看，仔魚階段是斑馬魚對酰胺類除草劑最敏感的生長階段這可能是因為處于該階段的斑馬魚既不具備代謝解毒能力，又沒有胚胎膜的保護。斑馬魚胚胎階段對于酰胺類除草劑的毒性為丁草胺>丙草胺>乙草胺，仔魚階段的毒性為丁草胺>乙草胺>丙草胺，幼魚階段的毒性為丙草胺>乙草胺>丁草胺，成魚階段的毒性為丁草胺>乙草胺>丙草胺。目前關于污染物對生物體某一生長階段的急性毒性或者慢性毒性效應研究較多，農藥對魚類的毒性等級劃分也僅局限于成魚階段[19]，單一生命階段的毒性試驗數據較為片面，不能客觀全面地反映污染物對生物的毒性。全周期試驗能夠模仿環境中生物的污染暴露情況，并且數據全面系統，也為進一步制定相應的毒性判斷標準提供參考數據， 且對農藥的生態風險評估以及水體污染的生物監測具有一定的指導意義。

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