利用重組大腸桿菌SOS法評價污水廠出水的遺傳毒性以及工藝去除效果

許燕，王明泉，逯南南，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質監測中心， 濟南 250021

1997年，國際標準化組織(International Organization for Standardization，ISO)將SOS/umu 試驗確立為該標準體系中唯一用于監測水環境遺傳毒性的標準方法，德國等發達國家也已將該試驗作為水環境遺傳毒性檢測的方法[1]。目前國際上最常用的SOS/umu測試系統是在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium TA1535)中導入攜帶umuC'-LacZ嵌合體的質粒pSK1002，構建的細菌S.typhimurium TA1535/pSK1002。這個系統在實際應用時存在以下問題：1)對氯代有機物不敏感，特別是不適用于飲用水中消毒副產物的檢測[2]；2)鼠傷寒沙門菌為致病菌，易傳播，每年全世界有近億人感染，部分致死，對構建的鼠傷寒沙門氏菌系統的操作存在微生物風險；3)對該系統的應用步驟相對繁瑣，對β-半乳糖苷酶活性的檢測需要加入底物，如β-ONPG(鄰硝基苯β-D-半乳糖苷)，價格相對較貴。

本文采用基于重組大腸桿菌SOS效應的水質遺傳毒性檢測方法[2]，使用重組大腸桿菌代替常用的鼠傷寒沙門氏菌，將大腸桿菌umuDC啟動基因序列與綠色熒光蛋白基因序列連接，與質粒載體連接后導入大腸桿菌，重組的大腸桿菌遇到致DNA損傷物，啟動綠色熒光蛋白基因表達進而產生綠色熒光蛋白，通過檢測產生的熒光獲得污染物信息。應用該技術對某市4座主要污水處理廠出水進行直接遺傳毒性效應測定，并以污水一廠為例對遺傳毒性的季節變化規律以及不同的工藝對水中直接遺傳毒性效應物質的去除情況進行了SOS效應-遺傳毒性測定。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：熒光光譜儀(HITACHI F-2700)；超聲波細胞粉碎儀(SCIENTZ-IID)；恒溫振蕩培養箱(上海志成 ZHWY-200B)；臺式離心機(Thermo)；固相萃取儀(Reeko SPE-06C)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅)。

圖1 污水處理一廠工藝流程圖Fig. 1 Process flow diagram of the No.1 sewage plant

試劑：4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4-NQO，美國Sigma公司)；二氧化氯、正己烷、甲醇均為色譜純。

1.2 污水處理工藝流程及工藝參數

目前，4座污水處理廠均采用改良后的A/A/O(厭氧-缺氧-好氧法)處理工藝，選擇污水處理一廠進行工藝段出水遺傳毒性檢測。污水處理一廠的主要處理工藝見圖1。

1.3 樣品采集和處理

采集5 L水樣經0.45 μm玻璃纖維素膜過濾后再用HLB柱(500 mg，OASIS，USA)富集，富集前HLB柱使用5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL純水進行活化，然后分別以5 mL正己烷/二氯甲烷(1:1，體積比)和10 mL甲醇/二氯甲烷(1:9，體積比)為淋洗劑洗脫。洗脫液吹干置換溶劑為DMSO，定容至0.5 mL，-20 ℃下保存，富集倍數為1萬倍。

1.4 重組大腸桿菌SOS效應-熒光法試驗方法

1.4.1 重組大腸桿菌貯藏物復蘇活化

將重組大腸桿菌貯藏物接入改良的LB培養液，加入氨芐霉素、葡萄糖，30 ℃、180 r·min-1的轉速下振蕩培養16～18 h。

1.4.2 大腸桿菌檢測液制備

將復蘇活化液按照1/100的比例接入新鮮的LB培養液，在37 ℃、200 r·min-1的轉速下振蕩培養2 h。

1.4.3 與受試樣品接觸

將受試樣品/大腸桿菌檢測液按照1/9的比例混勻(100 μL受試樣品:900 μL大腸桿菌檢測液)，在37 ℃、200 r·min-1的轉速下振蕩接觸1.5 h，設置3個平行組。設置不加檢測樣品，僅添加受試樣品溶劑的對照組；設置經固相萃取前處理的純水樣品為程序空白組。

1.4.4 檢測液后處理

將與受試物接觸后的菌液及對照組的菌液通過離心收集菌體，以PBS緩沖液洗滌1次，利用超聲波破碎儀破碎菌體。

1.4.5 熒光檢測

將菌體破碎物高速離心，收集上清液，利用熒光光譜儀檢測發射熒光強度。采用激發波長395 nm，檢測波長為507 nm。

1.4.6 數據處理與分析

R值=各濃度下的受試物熒光強度/相應空白，若與空白比值大于1.5，則認為該物質具有致突變性(呈陽性)。

對應標準毒性物質4-NQO劑量效應標準曲線，得出受試物的4-NQO毒性當量(TEQ4-NQOmg·L-1)。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 標準曲線及污水處理廠出水直接遺傳毒性測定

考慮到4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide, 4-NQO)是一種已由動物暴露試驗數據證明了的致癌物，也是一種不需要代謝活化直接引起遺傳物質損傷的直接遺傳毒性物，在umu 測試中也已經被廣泛用作陽性對照物進行質控[3]，因此在本研究中選擇4-NQO作為標準毒性物質，對直接遺傳毒性進行定量，程序空白組的R值為0.57。

使用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)為標準毒性物質制作劑量-效應標準曲線，見圖2。對該市4座污水處理廠夏季出水重組大腸桿菌SOS效應測試(結果見表1)，4座污水廠出水的R值均>1.5，表現出一定的直接遺傳毒性效應，對應的4-NQO當量濃度0.018～0.514 mg·L-1。由于各污水處理廠收集的生活廢水、工業廢水來源復雜多樣，經過常規污水處理工藝處理后，直接遺傳毒性效應對應4-NQO的當量濃度也有所差異。目前，該市4座污水處理廠出水水質達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918—2002)的一級A標準，但是經本實驗檢測仍然有較強的致突變性，這些經過常規工藝處理過的污水直接排入城市河流，進而污染自然水體。

圖2 4-NQO劑量-效應標準曲線Fig. 2 Dose-effect curve for 4-NQO

污水一廠TheNo.1sewageplant污水二廠TheNo.2sewageplant污水三廠TheNo.3sewageplant污水四廠TheNo.4sewageplantR值Ratiooffluorescence3.032.811.562.21TEQ4-NQO/(mg·L-1)0.5140.3110.0180.079

2.2 污水處理一廠不同季節進出水直接遺傳毒性測定及去除率

取污水處理一廠不同季節(春、夏、秋、冬)進出水樣品進行重組大腸桿菌SOS效應測試(結果見表2)，進廠水的直接遺傳毒性當量(TEQ4-NQO)為0.021～0.617 mg·L-1，出廠水的直接遺傳毒性當量(TEQ4-NQO)為0.016～0.514 mg·L-1；夏季進廠水直接遺傳毒性當量明顯高于其他3季，可能原因是該市夏季降水量較大，地表徑流中面源污染物隨著降水進入城市排水管道。夏季該污水廠直接遺傳毒性物質去除率最低為16.69%，在春季最高達到53.97%。由此可見，目前的污水廠處理工藝對直接遺傳毒性物質有一定的去除效果，但去除能力變化較大。

2.3 污水處理一廠工藝段出水直接遺傳毒性去除特征

取污水處理一廠主要工藝段出水樣品進行重組大腸桿菌SOS效應測試(結果見圖3)，污水處理一廠進廠水為陽性，改良A/A/O工藝出水是陰性，二沉池出水及出廠水為陽性，直接遺傳毒性比進廠水降低，出廠水較進廠水直接遺傳毒性去除率為23.8%。其中，改良A/A/O工藝段對直接遺傳毒性去除效果最佳(達到33.33%)，整體工藝對直接遺傳毒性物質有一定的去除效果。目前，國內外已有許多報道應用SOS/umu方法評價飲用水各個工藝段出水的遺傳毒性[4-6]，對于污水廠處理后的出水遺傳毒性效應的監測還未引起足夠的重視，遺傳毒性物質的去除也應納入污水廠工藝改進的考慮因素之一。

圖3 污水處理一廠工藝出水TEQ4-NQO及去除率Fig. 3 TEQ4-NQO and removal rate of direct genetic toxicity of water from the No.1 sewage plant

春季Spring夏季Summer秋季Autumn冬季Winter進廠水RawwaterTEQ4-NQO/(mg·L-1)0.3650.6170.0210.469出廠水TreatedwaterTEQ4-NQO/(mg·L-1)0.1680.5140.0160.272去除率/%Removalrate/%53.9716.6923.8142.00

3 討論(Discussion)

3.1 傳統SOS/umu測試方法和重組大腸桿菌SOS效應-熒光法應用于水質遺傳毒性評價的相關研究

目前，國內外學者大多采用Oda等[7]于1985年建立起來的SOS/umu測試方法，或者根據該方法改進優化的SOS/umu測試方法。該方法被廣泛應用于化合物和復雜樣品檢測的遺傳毒性檢測，國內學者將其應用于飲用水處理遺傳毒性評價也較多，見表3。

本研究應用重組大腸桿菌SOS效應-熒光法測試了某市4座污水處理廠排水的直接遺傳毒性，由于4座污水處理廠均采用改良后的A/A/O(厭氧-缺氧-好氧法)處理工藝，直接遺傳毒性效應對應的4-NQO濃度有所差異，這可能與4座處理廠的污水來源以及處理規模有關。傳統SOS/umu測試方法在污水或污泥樣本遺傳毒性測試的應用則相對較少，倪瀟瀟等[12]對造紙廠污水進行遺傳毒性評價，得出目前該廠現行活性污泥廢水處理工藝，對遺傳毒性物質(包括直接的和間接的)的去除作用不明顯，本研究測定的城市典型污水處理廠現行工藝對遺傳毒性物質去除率為16.69%～53.97%，總體去除效果也不甚理想。倪瀟瀟[13]等某城市4個典型污水處理工藝進行遺傳毒性評價，4個典型的城市污水處理工藝總體上對遺傳毒性物質都有一定的去除效果；其中A2/O處理工藝的去除效果最明顯；空氣曝氣活性污泥工藝對直接遺傳毒性物質的去除效果較好，與本研究中污水處理廠改進的A/A/O工藝對直接遺傳毒性物質去除效果較明顯一致。李莉[14]等應用該方法評價了北京市污水處理廠的生污泥樣品以及經過不同處理工藝處理后的污泥樣品的遺傳毒性效應，結果表明污水處理廠的污泥樣品的遺傳毒性都在控制范圍內，在本文尚未涉及到污泥樣品遺傳毒性效應的評價，這也將是以后研究的方向。

表3 SOS/umu 測試法應用于飲用水處理的相關研究Table 3 Some research about the application of SOS/umu testing in water treatment

3.2 重組大腸桿菌SOS效應-熒光法與傳統SOS/umu測試體系比較

本研究中實驗樣品經固相萃取前處理后，應用重組大腸桿菌SOS效應-熒光法測定水質直接遺傳毒性，每組測試設置了3個平行組，熒光強度標準偏差在7%～26%，精密度良好；測定4-NQO的檢測限為15.76 μg·L-1，對比Oda 等[15]使用傳統的SOS/umu測試體系測定4-NQO檢測限為28.5 μg·L-1，檢測限更低；菌液培養時間比傳統測試體系縮短了1 h，操作步驟更簡便且易于操作。

綜上所述，本研究使用固相萃取前處理和重組大腸桿菌SOS效應-熒光法測定水質直接遺傳毒性，操作便利、檢測敏感性較高、操作危險性較低，且使用4-硝基喹啉氧化物作為標準毒性當量物質，可以進行定量評價，行業推廣前景可期。

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