鉻在小鼠體內的蓄積效應與毒性

儀民，儀慧蘭，吳麗華

1. 山西大學 生命科學學院，太原030006 2. 太原師范學院 生物系，太原030031 3. Department of Statistics, University of Missouri Columbia, Columbia, MO 65211, USA

鉻(Cr)廣泛存在于人類生存環境中，除金屬鉻外，最常見的價態是Cr(Ⅲ)和Cr(VI)。全球鉻產量每年數千萬噸，其中60%～70%的鉻用于包括不銹鋼在內的合金生產，15%用于化學工業生產，主要是制革、顏料和電鍍[1]。工業排放及農業灌溉、施肥向環境釋放鉻，對環境微生物生態、動植物生理和人體健康產生了顯著影響[2-6]。Cr(Ⅲ)不溶于水，移動性差，而Cr(VI)易溶于水，移動性較高，釋放到土壤和水體中的Cr(VI)導致飲用水Cr(VI)超標[7-8]。近年來鉻污染事件在世界各地均有發生，鉻毒性受到全社會的關注。

為進一步評價Cr(VI)毒性，本文采用毒理學研究方法，通過飲水染毒方式研究Cr(VI)在實驗動物小白鼠體內的蓄積效應和毒性，旨在為鉻污染的安全性評價提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物分組

健康昆明種純系雄性小白鼠50只，體重(18 ± 2) g，由山西醫科大學提供。將小鼠隨機分為5組，每組10只，稱量并記錄小鼠體重。

1.2 實驗動物染毒

根據文獻報道中小鼠鉻半致死劑量(LD50=316 mg·kg-1)[14]，設置小鼠飲用水中含鉻(用重鉻酸鉀配制)濃度為15 mg·L-1，30 mg·L-1，50 mg·L-1和70 mg·L-1。

實驗動物自由取食和飲水，喂食山西醫科大學提供的專用全價大顆粒飼料，對照組飲用滅菌蒸餾水，鉻染毒組分別飲用不同濃度的鉻溶液。染毒期為30 d，觀察記錄期間動物的活動情況、飲食情況、精神狀態和中毒癥狀。

1.3 實驗動物解剖與取材

染毒結束后稱量小鼠體重，用頸椎脫臼法處死，迅即解剖觀察體內有無異常，摘取腦、心、肝、肺、腎、睪丸、脾臟等臟器，用預冷的生理鹽水浸洗，吸去表面浮水后稱重，置于玻璃瓶中備鉻含量測定。

1.4 骨髓細胞ROS和微核檢測

取小鼠股骨骨髓細胞，常規涂片，吉姆薩染液染色后鏡檢。每只動物觀察約1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，計數有微核的PCE數，計算細胞微核率。

圖1 飲用含鉻水對小鼠體重的影響Fig. 1 Effects of Cr (Ⅵ) intake by drinking water on body weight in mice

圖2 飲用含鉻水對小鼠臟器系數的影響Fig. 2 Effects of Cr (Ⅵ) intake on the ratio of organ to body weight in mice

取小鼠股骨骨髓細胞用磷酸鹽緩沖液制備細胞懸液，加入活性氧特異性熒光探針DCFH-DA(終濃度5 μmol·L-1)避光孵育30 min，熒光顯微鏡(BX51, Japan, Olympus)觀察、拍照，并用顯微成像系統附帶的Image Pro Plus 6.0軟件對ROS熒光信號進行定量分析。

1.5 鉻含量測定

取動物臟器加入體積比為5:1的硝酸:高氯酸溶液，加熱硝化。三蒸水溶解硝化物，二苯碳酰二肼分光光度法(GB 7467—87)測定鉻含量。

1.6 數據統計分析

采用SPSS 17.0對所得結果進行F檢驗后，用Duncan方法比較染毒組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, 差異顯著；**P<0.01, 差異顯著)。

2 結果(Results)

2.1 對小鼠鉻攝入量的影響

在整個實驗期間，實驗動物未出現死亡，攝食和精神狀態未見異常，但隨著飲用水中鉻含量的升高，小鼠的平均日飲水量減少。5個實驗組動物的平均周飲水量按鉻濃度由低到高依次為352.3 mL、329.4 mL、294.1 mL、223.8 mL和208.2 mL。由周飲水量和體重計算各組小鼠的鉻攝入量發現，隨著飲用水中鉻濃度的升高，小鼠對鉻的攝入量遞增，4個鉻染毒組小鼠的鉻攝入量日均值依次為1.96 mg·kg-1、3.50 mg·kg-1、4.52 mg·kg-1和5.80 mg·kg-1。

圖3 飲用含鉻水對小鼠臟器鉻含量的影響Fig. 3 Effects of Cr (Ⅵ) intake on Cr contents in the organs of mice

2.2 對小鼠體重的影響

染毒30 d后各組小鼠的體重均有不同程度增加，其中，蒸餾水對照組體重增幅最大，為初始體重的2.08倍；4個不同濃度鉻染毒組體重明顯低于對照，體重增量為對照組的54.19 %～75.61%，說明飲用水中高濃度六價鉻離子能影響小鼠的正常生理功能，進而抑制小鼠體重的正常增長(圖1)。

2.3 對小鼠臟器系數的影響

解剖觀察未發現小鼠體內異常，鉻染毒組小鼠主要臟器重量與體重的比值(臟體比)發生變化，其中，脾/體比值和腦/體比值升高，15 mg·L-1鉻染毒組脾/體比值顯著增高，50 mg·L-1鉻染毒組腦/體比值顯著增加了31%；腎/體比值與肝/體比值降低，腎/體比值降幅較大，在30～70 mg·L-1鉻染毒組中顯著降低；而心/體比值、睪丸/體比值和肺/體比值與對照組無明顯差異(圖2)。

計算染毒組與對照組小鼠臟器系數的相對值發現，雖然不同臟器對鉻毒性的敏感度不同，但隨著劑量增加，小鼠主要臟器的臟器系數均下降，說明鉻攝入量的增加是導致機體損傷的主要原因。

2.4 對小鼠不同臟器鉻含量的影響

染毒30 d后，小鼠不同臟器內總鉻含量的變化趨勢不盡相同(圖3)，反映了不同臟器鉻蓄積能力的不同。染毒組心臟鉻含量增幅最大，濃度50 mg·L-1和70 mg·L-1的染毒組總鉻含量顯著高于對照組，為對照組的2.20和1.59倍。脾臟中鉻累積明顯，鉻含量為對照組的1.43～1.81倍。染毒組的睪丸、肺臟、肝臟中鉻含量與對照組無顯著差異，但略有增加，其中睪丸中鉻含量為對照組的1.27～1.51倍，肺臟鉻含量為對照組的1.27～1.48倍，肝臟鉻含量為對照組的1.06～1.16倍。染毒組腎臟未發現鉻累積效應。

2.5 對小鼠骨髓細胞ROS水平和微核率的影響

不同劑量鉻染毒組小鼠的骨髓嗜多染紅細胞微核率均增加。在鉻濃度15～70 mg·L-1范圍內，細胞微核率顯著高于對照組，且隨著鉻濃度的增大而增加(圖4)。

經特異性熒光探針標記后，對照組細胞中僅可見微弱的熒光，而處理組骨髓細胞內ROS熒光信號明顯增強；定量分析發現，細胞ROS水平在鉻染毒組中顯著增高，并具有一定的劑量依賴性(圖5，圖6)。這表明鉻染毒組小鼠骨髓細胞ROS水平升高，也提示鉻通過食道攝入能引發實驗動物骨髓細胞的氧化脅迫。染毒組小鼠骨髓細胞ROS水平升高與骨髓嗜多染紅細胞微核率升高同時發生，說明微核的產生與染毒組胞內高水平的ROS有關。

圖4 鉻對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響Fig. 4 Effect of Cr (Ⅵ) intake on micronuclei frequency in mice marrow cells

圖5 小鼠骨髓細胞活性氧(ROS)熒光密度注：A, 對照組； B, 50 mg·L-1 Cr6+組。Fig. 5 Reactive oxygen species (ROS) fluorescence intensity in mice marrow cellsNote: A, Control; B, 50 mg·L-1 Cr6+.

圖6 鉻對骨髓細胞活性氧水平的影響Fig. 6 Effects of chromium on intracellular ROS levels in mouse marrow cells

3 討論 (Discussion)

本文采用昆明種小白鼠，經飲水攝入較多Cr(VI)后，出現了體重增長的抑制，與國內外學者在其他品系小鼠和大鼠中得到的結果[15-16]類似。臟器系數是實驗動物某器官質量與其體重之比值，是亞慢性毒性實驗的常用指標，可較好地反映化學物對該臟器的綜合毒害作用，臟器系數增大，表示該器官可能出現充血、水腫或增生肥大；臟器系數下降，說明臟器萎縮或其他退行性病變[15]。飲水鉻染毒出現脾臟和腦的臟器系數增大，腎臟和肝臟臟器系數下降，心臟、睪丸和肺臟臟器系數無明顯改變；小鼠心臟和脾臟中鉻含量明顯提高，出現一定的鉻蓄積，而肝臟和腎臟未檢出鉻蓄積，說明本研究染毒期間鉻的蓄積器官為心臟和脾臟，而毒效應靶器官為肝臟和腎臟，腦和脾臟亦受到一定影響。本結果與文獻報道的肝臟、腎臟為鉻蓄積器官[16]不同，可能是因為實驗動物的品系、染毒劑量、染毒期限不同造成的。因心臟和脾臟血流比較豐富，進入體內隨血液循環而轉運的鉻有更多的機會滯留在其中，也有可能心和脾臟組織對鉻離子有較高的親和力，導致心臟和脾臟中鉻含量較高。經口攝入的Cr(VI)因吸收率較低，多數由消化道隨糞便排出，其中被機體吸收的部分主要由尿液排出[16]。腎臟的基本功能是生成尿液，它是機體清除體內代謝產物及某些廢物、毒物的重要器官。腎臟中含鉻尿液的滯留增加了鉻對腎臟的毒性作用。肝臟是人體主要的代謝和解毒器官，鉻攝入引發的氧化脅迫及代謝紊亂會增加肝細胞負擔，引發對肝組織細胞的毒性作用[17-18]。因此，肝腎組織可能會因鉻的氧化損傷出現細胞死亡[17-19]，導致器官重量減輕，相應的臟器系數下降。

微核是細胞受遺傳毒物作用后在細胞分裂過程中形成的形態學上的一種可見標識，是檢測化學物質遺傳毒性的主要指標之一。本研究發現，通過飲水攝入Cr(VI)可誘發小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率升高，骨髓組織細胞內ROS水平升高，說明經消化道攝入過量Cr(VI)能引發實驗動物骨髓細胞的遺傳損傷和氧化脅迫。鉻遺傳毒性的出現，預示著細胞遺傳物質的變異，及腫瘤發生或子代畸形的高風險。骨髓是動物的干細胞庫，與機體造血功能、免疫細胞形成等密切相關，骨髓細胞受損會影響相關的造血過程、免疫功能等，引發機體生理異常。鉻染毒組小鼠體重增長抑制可能與骨髓細胞氧化損傷，引發體內供血不足繼而影響機體的正常生理過程有關。

綜上所述，六價鉻離子染毒30 d能引發小鼠的肝、腎毒性，使主要臟器內總鉻含量改變，其中心臟和脾臟鉻含量顯著增高。

由消化道攝入的六價鉻離子，引發了骨髓組織細胞的氧化脅迫和遺傳損傷，與機體生理功能紊亂和疾病發生有關。

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