寨卡病毒與登革熱病毒交叉反應抗體引發嚴重性疾病的關系

嚴延生，翁育偉

寨卡病毒與登革熱病毒交叉反應抗體引發嚴重性疾病的關系

嚴延生1,2,3，翁育偉1,3

登革病毒(DENV)不同血清型感染后，易導致抗體依賴增強反應(ADE)的嚴重性疾病發生。2015年5月巴西流行寨卡病毒(ZIKV)后，截止至2016年11月，流行已擴散到60多個國家和地區，毗鄰我國的一些東南亞國家也有報告ZIKV感染病例。近期有研究顯示，ZIKV和DENV的包膜(E)蛋白EDI和EDII兩表位引發的抗體或由此產生的單克隆抗體具有很強的交叉反應性，易引起ADE的發生。我國沿海省份歷年時有DENV病毒流行，今后ZIKV流行事件極有可能發生，因此，由該病毒流行引起的嚴重性疾病發生我們必須要關注和提出應對措施。

登革病毒；寨卡病毒；交叉反應蛋白；嚴重性疾病

Supported by Chinese national high technology research and development program(No.2011AA02A114)

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)與登革病毒(Dengue virus，DENV)感染，除前者已有報道可引起出生缺陷如小頭癥(Microcephaly)、神經系統疾病如格林巴氏綜合征(Guillain-barre syndrome)外，這兩種病毒的單獨感染大多表現為輕癥。但近期一些在國際上影響力很大的期刊報道了實驗室所做的ZIKV和DENV先后相互感染可能因抗體依賴的增強感染作用(antibody-dependent enhancement，ADE)而引發嚴重性疾病[1-5]的報道，除個別理論有相互矛盾外，其研究、設計及結果均屬上乘。那么，這兩種病交互感染、相互影響在多大程度上產生嚴重臨床后果？這值得我們關注。

登革熱是我國重點關注的季節性傳染病。受東南亞等國家流行的影響，我國一直有登革熱的輸入，并造成東南沿海地區常發生登革熱的流行甚至暴發[6]。除在中、南美洲發生流行外，2016年ZIKV已經在東南亞發生并新加坡等國家流行[7]，我國也已報道發現27例輸入性病例。2017年夏季及以后年份，我國東南沿海地區流行ZIKV的可能性是存在的。因此，我們需要了解ZIKV流行的后果，以做必要的防備。

1 近期ZIKV和DENV的疫情

2015年巴西流行寨卡病毒(ZIKV)，世界衛生組織(WHO)于2016年2月1日宣布寨卡病毒疫情為“國際關注的突發公共衛生事件”。截止至2016年11月18日，流行已擴散到60多個國家和地區。雖然WHO宣稱該病毒不再構成國際突發公共衛生事件，但該病毒仍具有“高度影響及長期問題”。

寨卡病毒感染的主要途徑是由埃及伊蚊、白蚊伊蚊等叮咬引起，但也可通過性傳播及垂直傳播途徑感染[8-11]。大多數寨卡病毒病表現為無癥狀或輕癥感染，但有證據表明ZIKV感染可引起神經系統并發癥如格林巴氏綜合征、小兒小頭癥等先天性出生缺陷綜合癥等，這些疾病的產生可能與ZIKV感染人神經前體細胞有關[12-13]。更為嚴重的是，由DENV與ZIKV病毒誘導的血清抗體存在嚴重交叉反應，不同病毒的持續感染可能導致ADE效應的發生，從而導致ZIKV的感染可引發登革熱流行地區的嚴重性寨卡病毒病的發生；反之亦然，DENV在寨卡病毒病流行區的流行，也可引發登革熱嚴重性疾病的發生，如登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever，DHF)或登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)。

2 抗體依賴增強感染作用(ADE)

ADE的產生是由于具反應性但非中和性的抗病毒抗體通過抗體的Fc段，介導病毒侵犯宿主細胞，導致細胞的感染性增強現象。一些非容許(non-permissive)細胞缺乏特異性病毒結合受體，但具有Fc結合受體，因此，病毒-抗體復合物可通過抗體Fc段，結合到細胞表面，引起病毒內吞，從而導致細胞感染，該現象在細胞培養實驗室很常見，但除登革熱外，在其他活體上很少見。病毒可以利用這個機制感染人的免疫細胞，從而引起一系列輕度到危重疾病的發生[14]。

DENV有4 種血清型，即DENV1～4。DENV 感染后可產生多種抗體。通常DENV感染可產生對該型病毒終身免疫的IgG中和抗體，可保護同型再感染不引起疾病。同型病毒的中和抗體衰減很慢，大多由長壽記憶性B細胞產生。機體也可產生對異型DENV的交叉保護抗體，但這種交叉保護IgG中和抗體逐漸衰減，最長可在4～20年后消失。除了產生中和抗體外，DENV感染也可產生部分中和或者完全不中和病毒的所謂病毒反應性抗體，這種反應性抗體對異型DENV非但沒有中和病毒的作用，反而像電腦的“木馬”病毒那樣，騙過了樹突狀細胞(或是被另一系的樹突狀細胞誤讀)，使其發生胞噬作用將病毒裹入細胞內，病毒在白細胞內繁殖而造成高病毒血癥，使疾病惡化[15]，這種感染作用即是所謂登革熱ADE發生的機制?；蛟S，發生在古巴的一次事件，可以真實、典型的說明登革熱ADE的現象。

1977-1979年，古巴曾發生過登革熱的流行，當時流行的病毒血清型系DENV1。此次流行后，該國又分別于1981和1997年發生兩次DENV2引起的流行。在1997年流行中[16]，發現報告了205例DHF/DSS病例，所有病例均大于15歲，除3個病例外，202個病例均在1977-1979年感染過DENV1，該病例數3-4倍于發生在1981年的DHF/DSS病例。這恰恰說明了在1981年時，不少病例體內還存在著1977-1979年感染后產生的異源中和抗體，所以1981年時發生DHF/DSS病例少；而到了1997年，異源中和抗體衰減至已不能保護異型感染，因此發生了多數DHF/DSS病例[17]。

3 ZIKV和DENV的交叉反應性

ZIKV和DENV均屬黃病毒屬成員。該屬病毒結構呈二十面體球形對稱，大小約為40～65 nm。病毒包含一個直徑約 25～30 nm的核衣殼，以及由宿主細胞膜介導的脂質雙分子層包膜，包膜嵌合有病毒包膜蛋白(Envelop，E)和膜蛋白(Membrane，M)。病毒的基因組為大小約為11 kb不分節段的單股正鏈RNA，基因組RNA的5′末端有1個甲基化帽狀結構用于細胞翻譯，3′末端為多聚腺苷酸。病毒基因組RNA可作為mRNA翻譯產生單個長鏈多聚蛋白(5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′)，多聚蛋白可被宿主細胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解為衣殼蛋白(Capsid, C),膜前體蛋白(pre-membrane, preM), 包膜蛋白(Envelop，E), 和7個非結構蛋白(Non-structure, NS)[13]。

黃病毒屬成員以蜱或蚊蟲作為傳播媒介，主要有黃熱病毒(YFV)、西尼羅病毒(WNV)、裂谷熱病毒(MVEV)、日本腦炎病毒(JEV)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、DENV、ZIKV等，多為致人疾病或地區性流行的病毒。

除了同為伊蚊蟲媒傳播病毒外，ZIKV在遺傳進化上與DENV也很接近(見圖1)。在本次美洲ZIKV高流行區，從血清學上區分ZIKV或是DENV的感染是比較難的，主要在與這兩種病毒感染后血清學呈現嚴重的交叉反應。

ZIKV和DENV兩種病毒表面均有E蛋白，其主要介導病毒與細胞的吸附、融合，可誘導宿主產生中和抗體。研究表明，ZIKV與DENV的E蛋白存在高度相似性，登革熱病毒4 種血清型間的E蛋白氨基酸序列差異約為30%～35%，而與ZIKV的差異依次為41%～64%。E蛋白主要由3個結構域(Domain)，即ED I～III組成。ED I功能表現在病毒侵入時膜蛋白構象發生變化，ED II含有融合環，ED III功能是使病毒結合到細胞受體上。ZIKV的ED I、II、III對應于DENV的ED I、II、III分別有35%，51%和29%的氨基酸同源性。根據ZIKV E蛋白二聚體構象及抗原性分析，其與DENV發生交叉反應的部分主要在ED II和毗鄰區域。而對ED III區來說，約有90%(27/30)ED III單抗是互為特異的[2]，因此，E蛋白的ED III區相對是特異的。

枝上所列為各病毒代表株名，其前面為其全基因組序列的登錄號(GenBank asession number)，以基孔肯亞病毒為外群(out-group)。圖1 部分人感染黃病毒代表株的遺傳進化圖Fig.1 Genomic-based phylogenetic tree of partial representative Flaviviridae viruses causing human infection. The accession number of sequence deposited in GenBank is prior to the viral designation and the Chikungunya virus is indicated as out-group.

除E蛋白外，另一與病毒的免疫侵入、致病性、血清學早期檢測和ADE有關且研究較為廣泛的蛋白為病毒非結構蛋白NS1。ZIKV與DENV等黃病毒基因組編碼了7個非結構蛋白，已知NS3 和 NS5 具有基因組復制和蛋白加工的催化作用；NS2A、NS2B、NS4A和 NS4B是短的轉膜蛋白，其主要功能在于錨定NS3 和 NS5到細胞質內質網膜邊的囊泡上[2]。ZIKA的NS1有附著在細胞內膜上的二聚體和由感染的細胞分泌的六聚體，其 NS1的結構與DENV基本一致，但ZIKV NS1的靜電電荷與DENV不一致，DENV NS1為陽電荷，ZIKV NS1則為陰電荷[18]，且ZIKV表現單一的嗜神經特征。抗體交叉反應引發的抗體依賴感染增強作用在黃病毒屬某些成員中普便存在，但主要是E蛋白而不是NS1蛋白，前者主起中和反應，抗體交叉反應也由其引發；后者主要功能在病毒復制方面[19-20]。

4 ZIKV和DENV相繼感染誘發抗體依賴增強作用

DENV異型感染可引發ADE并可導致嚴重臨床癥狀的發生。而ZIKV在2015年5月才開始在美洲特別是巴西大范圍流行。曾感染過DENV，再感染ZIKV是否加重寨卡病毒病，反之亦然。因此在B和T細胞水平上剖析兩者間免疫交叉反應及其水平顯然很重要。

Stettler等[5]從4個近期感染ZIKV恢復期患者(稱ZIKV供體)采集的B細胞與鼻咽癌細胞株融合制備了119株人型單抗進行此項研究。在這4個恢復期患者中，2個未感染過DENV(ZIKV-A和-D)；另2個曾感染過DENV(ZIKV-B和-C)。根據其結合ZIKV NS1或E蛋白以及它們能夠中和ZIKV感染的能力來比較分析它們的特征。同時，與另一組感染DENV恢復期患者(稱DENV供體)制備的單抗進行比對分析。所有這些單抗均產生IgG抗體，強調這個抗體的種類，主要是它們可結合Fc受體，從而進行ADE發生的分析。

在119個ZIKV單抗中，41個可結合ZIKV NS1，其中部分可與DENV的NS1產生交叉反應；其中，從既往未感染DENV的供體(ZIKV-A，-D)中獲得的單抗，與DENV的交叉反應要明顯少于從既往曾感染過DENV的供體(ZIKV-B，-C)。而從DENV感染者中獲的NS1反應性單抗，除1株外，與ZIKV無交叉反應性，但普遍存在DENV型間的交叉反應。盡管DENV和ZIKV的NS1蛋白存在51%～53%的氨基酸同源性，但兩者誘導產生的單抗多具有特異性特征。此外，供體的CD4+記憶性T細胞分析表明ZIKV的NS1蛋白是特異的，與DENV只存在較低水平的交叉反應。上述特征提示NS1抗體可應用于檢測試劑的開發[21]。

在E蛋白的單抗中，從ZIKV供體獲得的單抗株中有65%(24/37)與DENV的E蛋白起交叉反應，而來自DENV供體的單抗株中亦有67%(31/46)與ZIKV的E蛋白有交叉反應。在上述交叉反應性單抗中，絕大部分識別ED I和II結構域，僅有少數單抗識別病毒ED III結構域。這些分析表明，E蛋白尤其是ED I/II 的血清抗體在ZIKV和DENV中存在較為嚴重的交叉反應。相反，不管是來自于ZIKV感染或是DENV感染的供體單抗，約有90%(27/30)ED III單抗是互為特異的，E蛋白的ED III區相對是特異的。此外，研究還發現供體中還包含一類具有病毒中和活性的非E蛋白結合單抗(Neutralizing non-E binding，NNB)。

為進一步了解ZIKV和DENV抗體的生物學特征，該研究選擇一組ZIKV單抗平行進行結合、中和以及ADE激活的研究。該組單抗同時含有FcγR和補體結合的抗體，以及對應的LALA突變抗體(LALA突變是指分別在抗體分子234和235位點氨基酸發生亮氨酸(L)到丙氨酸(A)的替換突變，該突變可導致抗體無法結合FcγR)。結果表明，ED III特異性單抗具有較高的中和活性，盡管可增強ZIKV對非容許人白血病細胞系K562細胞的感染，但在高濃度(1μg/mL)條件下，ED III特異性單抗的ADE效應可被抑制；相反，ED I/II特異性單抗僅具有部分中和活性，但卻能有效增強ZIKV對K562細胞的感染，誘導ADE效應。NNB單抗同樣可誘導ADE效應。

用上述4份ZIKV感染者恢復期血清來分析ADE作用，結果表明，ZIKA ED III特異的LALA型單抗ZKA64能完全阻斷ZIKV的ADE發生，而用DENV ED I/II特異的LALA型單抗DV82株單抗可以完全阻斷DENV1型的ADE，但只能部分阻斷ZIKV的ADE。 進一步地，預先注射非LALA型的ED I/II交叉反應性單抗ZIKV (ZKA78) 或 DENV(DV82)，均能夠增加DENV2對AG129小鼠的致死性感染，表明ZIKA免疫后很容易增強DENV感染的致病力。盡管沒有觀察到交叉反應性單抗DV82增強ZIKA對免疫缺陷小鼠的感染以及致病力現象，但由于病毒感染后普遍存在交叉反應性抗體，因此，上述結果表明ZIKV和DENV異源感染使宿主ADE的發生完全是可能的。

5 結 語

據泛美衛生組織和世界衛生組織(PAHO/ WHO)2016年12月30日公報稱，2016年ZIKV在美洲和其他地區迅速傳播，截年末，美洲共報告超50萬例ZIKV感染病例(包括疑似和確診病例)。寨卡疫情已從突發公共衛生事件轉變為長期公共衛生挑戰。寨卡疫情與登革熱疫情密切相關，如南美最大的國家巴西寨卡疫情嚴重，到2016年7月份小頭癥病例報告就達2500多例；不僅如此，由于寨卡疫情緣故，其奧運會的主辦權曾一度受到質疑；就登革熱疫情來說，截2016年8月26日，巴西52周的流行病監測報告可疑病例為1 649 008例，報告確診病例500 972例，嚴重病例1 569例，死亡863人，其嚴重病例占確診病例約0.3%，死亡病例則占嚴重病例的一半以上，雖然巴西登革熱嚴重病例比例較低，但巴西4種血清型DENV均常年流行[22]，不能完全排除其異源感染導致的嚴重病例和死亡發生。

新加坡已發現寨卡病例的感染和流行[7]，泰國、菲律賓、越南、日本和中國等東南亞國家都已有輸入性寨卡病例的報道，因此2017年及其后發生ZIKV流行的機率大；我國廣東、福建、浙江和海南等省毗鄰東南亞，時有輸入性登革熱并引發本土登革熱流行事件的發生，因此防范ZIKV和DENV流行并從臨床上加強對ADE發生的應對應是這些省份每年的重點任務[23]。

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Relationship of severe diseases that induced by cross-reactivity antibodies elicited by infection of Zika virus and Dengue virus

YAN Yan-sheng1,2,3，WENG Yu-wei1,3

(1.FujianCenterforDiseasecontrolandPrevention,Fuzhou350001China; 2.PublicHealthSchoolofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350004China；3.FujianProvincialKeyLaboratoryofZoonoses,Fuzhou350001China)

Severe infectious diseases, i.e. antibody-dependent enhancement (ADE) resulted from successive infection with different serotypes of dengue virus. After its introduction into Brazil in 2015, Zika virus has spread rapidly to more than 60 countries and regions by the end of November 2016. Some south-east Asian countries including China have also reported cases of ZIKV infection. In recent studies, it was observed that sera cross-reactivity antibodies or such monoclonal antibodies have been elicited by two domains,ED1 and ED2,of envelope (E) protein on Zika or/and Degue virus, and ADE was easily induced by such antibodies. Dengue fever epidemic often occurred in Chinese coastal provinces each year.Then,it will be followed by Zika virus disease. Therefore, we must pay attention to and propose replying measurement for it.

dengue virus;zika virus;cross reaction;exacerbation of disease

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.001

國家高技術研究發展計劃(No.2011AA02A114)資助

1.福建省疾病預防控制中心，福州 350001； 2.福建醫科大學公共衛生學院，福州 350001； 3.福建省人獸共患病重點實驗室，福州 350001

R373.3

A

1002-2694(2017)02-0093-05

2016-11-26 編輯：李友松