脫落酸對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

李慧萍，丁傳波，徐曉華，鄭毅男，李瑩，高銘彤，李婧毓， 劉一桐，曾露露，劉峰*，劉文叢*(.吉林農業大學中藥材學院，長春 308；.吉林大學中日聯誼醫院，長春 3003)

脫落酸對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

李慧萍1，丁傳波1，徐曉華2，鄭毅男1，李瑩1，高銘彤1，李婧毓1， 劉一桐1，曾露露1，劉峰2*，劉文叢1*
(1.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；2.吉林大學中日聯誼醫院，長春 130031)

研究脫落酸(ABA)對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用。70只ICR小鼠隨機分為空白組、空白對照組、模型組、聯苯雙酯組、ABA高、中、低劑量組，連續ig給藥10 d，于末次給藥1 h后，除空白組和空白對照組按0.01 mL/g注射橄欖油外，其余各組均按體重注射體分數10%的CCl4(CCl4用橄欖油稀釋)，6 h后，脊椎脫臼處死小鼠，收集血液，檢測血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-c水平，取肝臟制備肝勻漿測定GSH-Px、MDA、SOD活性，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。結果表明：ABA各劑量組均能明顯改善因CCl4造成肝損傷引起的血脂異常，一定劑量的ABA可以降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST水平的升高，降低肝勻漿中小鼠MDA含量，升高SOD、GSH-Px活性，減輕CCl4對肝組織的病理損傷。ABA對CCl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用，其保護機制可能與改善小鼠因CCl4致小鼠急性肝損傷引起的血脂異常，清除自由基，抑制脂質過氧化，減輕肝組織的損傷有關。

脫落酸；四氯化碳；肝損傷；保肝作用

脫落酸(abscisic acid, ABA)是一種常見的植物激素之一，在植物生命周期中起著重要的調節作用，包括調節植物生長、發育、分化、休眠等；調節植物對多種逆性環境的抗逆反應，如抗旱、抗寒、抗低溫等[1-2]。近年來的研究表明，脫落酸抗糖尿病[3-4]、抗癌[5-6]、抗炎[7-8]并對心血管細胞、干細胞等有顯著的調節作用[9-10]，有可能對于多種疾病的治療起重要的作用，脫落酸可能在防治動物疾病,保障畜牧業發展的同時,為提高人民生活水平,促進人類健康發揮著巨大作用。目前對于脫落酸對四氯化碳致小鼠肝損傷的影響，尚未見研究報道，本研究探討了四氯化碳對小鼠造成急性肝損傷保護作用及其機制，以期為臨床應用脫落酸治療化學藥物引起肝臟等臟器損傷的動物提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器 ABA購于美國Sigma公司，谷氨酸氨基轉移酶(ALT)(批號：20160122)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)(批號：20160122)、丙二醛(MDA)(批號：20160123)、超氧化物歧化酶(SOD)(批號：20160123)、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)(批號：20160122)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，TG、TC、HDL-C(批號：20160115)試劑盒購于北京北化康泰臨床試劑有限公司，聯苯雙脂(北京太洋藥業有限公司)、四氯化碳購于北京化工廠。BP211D電子天平(德國Sartorious公司)，SpectraMax Plus384連續光譜掃描式酶標儀(美國分子儀器公司)、中佳HC-2517高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.2 動物分組及給藥 SPF級雄性ICR小鼠(18～22 g)，購自吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(吉)2007-0003。將小鼠隨機分為7組，每組10只，分別為空白組、空白對照組、模型組、聯苯雙酯組、ABA高、中、低(80、40、20 mg/kg)劑量組，ABA用0.5%的CMC-Na助懸，空白組和模型組灌胃于0.5% CMC-Na,空白對照組灌胃ABA，劑量為40 mg/kg，各給藥組給藥10 d，第10 天給藥結束后，除空白組、空白對照組注射橄欖油外，其余各組均腹腔注射10%的CCl4(CCl4用橄欖油稀釋)，建立急性肝損傷模型。腹腔注射后禁食不禁水，6 h后摘取眼球，收集血液，30 min后，在4200 r/min、4 ℃下離心10 min，吸取血清。摘除肝臟，用冰的生理鹽水洗凈臟器上的血液，擦干后稱重。血清、肝臟在-70 ℃冰箱里保存以待檢測各項生化指標。1.3 生化指標的測定 小鼠血清：按試劑盒說明用SpectraMax Plus384連續光譜掃描式酶標儀測定ALT和AST活性以及血脂指標(TC、TG、HDL-C)。取各小鼠肝臟相同部位的肝組織，用4 ℃生理鹽水按質量比1∶9，制備10%的肝勻漿，4200 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液，按試劑盒說明用SpectraMax Plus384連續光譜掃描式酶標儀測定MDA、SOD和GSH-Px活性。

1.4 肝組織病理學觀察 取小鼠肝臟相同部位的部分肝臟組織進行病理學組織觀察，用體積分數為10%的甲醛固定，固定后的肝組織乙醇脫水，石蠟包埋，HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.5 統計學處理 實驗所得數據均用統計軟件SPSS17.0中One-way ANOVA進行處理，各組數據均用Mean±SD表示。P<0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 ABA對CCl4致肝損傷小鼠血清中ALT和AST的影響 空白對照組與空白組相比，小鼠血清中ALT和AST沒有明顯變化，提示ABA對正常小鼠肝臟不具有破壞作用，而模型組與空白組相比，模型組血清中ALT、AST水平極顯著升高(P<0.01)，說明小鼠造模成功；與模型組相比，ABA中劑量組(40 mg/kg)與聯苯雙酯(150 mg/kg)均能顯著性降低小鼠血清ALT水平(P<0.05)，高、低劑量對此無影響；而ABA高、中、低三個劑量給藥組與聯苯雙酯組均能顯著性降低小鼠血清中AST水平(P<0.05)，提示ABA具有明顯的保肝活性，在降低AST水平方面，高劑量組與陽性組相比不具有顯著性差異，提示在降低AST水平上，其與陽性組相當，結果見表1。

表1 ABA對肝損傷小鼠血清中ALT和AST的影響

注：與空白組比較，##P<0.01； 與模型組比較，**P<0.01,*P<0.05

2.2 ABA對CCl4致肝損傷小鼠血清中血脂的影響 空白對照組與空白組小鼠相比，小鼠血清中TG、TC、HDL-C水平基本持平，表明ABA(40 mg/kg)不影響正常小鼠血脂水平。而空白組與模型組相比，模型組TG、TC水平明顯升高(P<0.01)，HDL-C水平明顯降低(P<0.01)，說明小鼠血脂出現異常，造模成功。而通過提前灌胃ABA干預各組中，高劑量組顯著性降低了小鼠TG水平(P<0.05)，極顯著性降低了TC水平(P<0.01)，極顯著的升高了小鼠血清中HDL-C水平(P<0.01)，中劑量的ABA極顯著性的降低了小鼠TG、TC水平(P<0.01)，極顯著的升高了小鼠HDL-c水平(P<0.01)，低劑量的ABA顯著性的降低了小鼠TG水平，顯著性升高了HDL-C水平，極顯著性降低了小鼠TC水平，ABA各個給藥劑量在調節肝損傷小鼠上皆優于聯苯雙酯組，揭示了ABA能夠很好的修正小鼠因CCl4所致肝損傷而引起的血脂異常，結果見表2。

表2 ABA對肝損傷小鼠血清中TC、TG和HDL-C的影響

2.3 ABA對CCl4致肝損傷小鼠肝組織抗氧化活性和脂質過氧化水平影響 與空白組相比，注射CCl4后的模型組小鼠肝臟中SOD和GPx活性極顯著性降低(P<0.01)，MDA水平極顯著性升高(P<0.01)，揭示了經CCl4造模小鼠抗氧化防御能力降低，細胞膜被破壞，引起了脂質過氧化反應。而ABA提前干預組能夠逆轉肝細胞中抗氧化酶的降低，MDA含量的升高，說明ABA對CCl4所致小鼠肝損傷有一定的保護作用，且高、中劑量的保護作用與聯苯雙酯組相當(表3)。

表3 ABA對肝損傷小鼠肝臟中SOD、GSH-Px和MDA的影響

2.4 ABA對急性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響 光鏡下可看到空白組與空白對照組小鼠，肝細胞排列緊湊，大小均一，呈放射狀排列，無明顯的病理改變；模型組小鼠，肝細胞排列不規則，呈現灶狀壞死，炎細胞浸潤，細胞核大小不等,細胞出現溶解等，肝小葉界限模糊，有些可明顯看到雙核緊連。與模型組相比，ABA及聯苯雙酯組能不同程度的改善肝細胞的變性壞死，其中高、中劑量組與聯苯雙酯組能明顯改善肝臟損傷程度，使大部分細胞結構完整。揭示ABA對四氯化碳致小鼠肝損傷有一定的保護作用(圖1)。

3 討論與小結

CCl4誘導的肝損傷模型是急性肝損傷研究的典型模型，因其誘發急性肝損傷病理學表現為肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤, 與臨床病毒性肝炎病理變化極為相似。CCl4在肝細胞中通過細胞色素P450 的作用分解為三氯甲烷自由基( CCl3·)，該自由基能與蛋白質共價結合導致蛋白合成障礙,引起脂質分解代謝紊亂，CCl3·能迅速與氧結合轉化為過氧化三氯甲烷自由基( CCl3O2·)，引起一系列的脂質過氧化反應[11-13]。

肝組織是谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)富集的場所，當肝細胞受到損傷或壞死時，大量的ALT和AST外泄至血清中，此時二者在血清中含量較高，因此，血清中的轉氨酶含量高低，是檢測肝細胞是否有損傷的重要指標。本實驗中，模型組小鼠血清中含有較多的ALT和AST，與空白組有極顯著差異(P<0.01)，說明小鼠肝臟受損較為嚴重，聯苯雙酯和ABA中、低劑量組能夠顯著性的抑制ALT和AST的增加(P<0.05)，ABA高劑量對ALT水平無明顯的影響，但能顯著性降低AST水平，揭示ABA具有一定的保肝活性。

肝臟在酯類物質代謝過程中具有重要作用，肝臟受到損傷時，酯類物質代謝受到障礙，血液中血脂發生紊亂，出現異常。CCl4是較為常見的肝毒性物質，進入肝臟后，通過脂質過氧化引起肝損傷，造成肝臟中血脂異常，表現為TG在血清中積累，TC水平升高，HDL-c水平降低。本實驗中，ABA與聯苯雙酯組均能夠明顯的降低小鼠血清中TG和TC水平，明顯的升高HDL-c水平，其中給藥組中劑量組在改善小鼠血脂異常方面與與聯苯雙酯組基本一致，提示ABA可能是通過改善小鼠因CCl4造成肝損傷而引起的血脂異常，起到保肝作用，這可能是ABA保護受損傷肝臟的重要機制之一。

圖1 肝臟病理學觀察(HE, ×200 )

SOD是一種抗氧化酶，它在預防由自由基引起的肝損傷中起到重要的作用,是抗氧化的第一道防線，它又可以將超陽陰離子歧化為H2O2，而GSH- Px 是滅活氧自由基的一種酶,可將H2O2轉化為H2O, 還可以阻斷體內脂質過氧化的進程, 使脂質過氧化物還原成的羥基化合物[14]。MDA 是氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，其含量的變化可間接地反映組織中氧自由基含量的變化。因此可通過測定SOD、MDA 含量來反映機體抗氧化的能力[15]。本實驗中，模型組小鼠肝臟MDA水平升高，抗氧化酶SOD活性及GSH- Px水平降低，揭示小鼠肝臟抗氧化防御系統降低，同時引起脂質過氧化反應。ABA預處理組逆轉了這種趨勢，高劑量相對于模型組組而言，對肝臟內指標均有明顯改善，低劑量和中劑量對肝臟中MDA水平無明顯影響，但能很好地改善SOD活性和GSH-Px水平，減輕其損傷，揭示了一定劑量的ABA可能通過提高小鼠抗氧化防御系統，抑制脂質過氧化水平而保護肝臟，這可能是其保護肝臟的另一重要機制。

因此，ABA可能是通過修復小鼠細胞膜，制止ALT、AST外泄；調節因肝損傷引起的血脂異常；提高抗氧化防御系統和抑制脂質過氧化水平；減輕肝組織病理學損傷，保護傷損的肝臟。這為ABA在保肝方面的開發利用提供了一定的理論依據。

[1] Cutler S R, Rodriguez P L, Finkelstein R R,etal. Abscisic acid: emergence of a core signaling network[J].AnnuRevPlantBiol, 2010, 61: 651-679.

[2] Kim T H, Bohmer M, Hu H Nishimura N,etal.Guard cell signal transduction network: advances in understanding abscisic acid, CO2, and Ca2+signaling [J].AnnuRevPlantBiol, 2010, 61: 561-591.

[3] Bruzzone S, Bodrato N, Usai C,etal. Abscisic acid is an endogenous stimulator of insulin release from human pancreatic islets with cyclic ADP ribose as second messenger[J].JBiolChem, 2008, 283 (47): 32188 -32197.

[4] Guria J, Hontecillas R, Ferrer G,etal. Loss of PPARγ inimmune cells impairs the ability of abscisic acid to improve insulin sensitivity by suppressing monocyte chemoattractant protein - 1 expression and macrophage infiltration into white adipose tissue[J].JNutrBiochem, 2008, 19: 216-228.

[5] Guzzo J, Jobin M P, Delmas F,etal. Regulation of stress response inOenococcusoenias a function of environm ental changes and growth phase[J].IntlJFoodMiocrbiol，2000, 55(1(3):27-31.

[6] 馬秋野，武步強，盧永剛，等.脫落酸對SMMC-7721人肝癌細胞誘導分化作用的研究 [J].昆明醫學院學報, 2006(3): 14-18.

[7] Bodrato N, Franco L, Fresia C Guida L,etal. Abscisic acid activates them urine microg- lial cell line N9 through the second m essenger cyclic ADP - ribose [J].JBiolChem, 2009, 284(22): 14777-14787.

[8] Guria J, Misyak S A, Hontecillas R,etal. Abscisic acid ameliorates atherosc- leros is by suppressing macrophage and CD4 (+) T cell recruitment into theaortic wall[J].JNutrBiochem, 2010, 21 (12):1178-1185.

[9] Magnone M, Bruzzone S, Guida L,etal. Abscisic acid released by human m on-ocytes activates m onocytes and vascular smooth muscle cell responses involved in a therogenesis[J].JBiolChem, 2009, 284 (26): 17808-17818.

[10]Scarfi S, Ferraris C, Fruscione F,etal. Cyclic ADP - ribose- mediated expansion and stimulation of human mesenchymal stem cells by the planthorm one abscisic acid[J].StemCells, 2008, 26(11):2855-2864.

[11]Mantawy E M, Tadros M G, Awad A S,etal. Insights antifibrotic mechanism of methyl palmitate: impact on nuclear factor kappa B and proinflammatory cytokines[J].ToxicolApplPharmacol, 2012, 258(1):134.

[12]Recknagel, R O. A new direction in the study of carbon tetrachloride hepatotoxicity[J].LifeScience, 1983, 33：401-408.

[13]Recknagel R O, Glende E A, Jr Dolak J A,etal. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity[J].PharmacologyandTherapeutics, 1989,43：139-154.

[14]趙文璽，金梅花，李天，等.草蓯蓉水萃取物對四氯化碳致肝損傷小鼠肝臟氧化應激的干預作用.中國中藥雜志[J].2013,38(6): 875-878.

[15]Esterbauer H, Schaur R J, Zolner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes[J].FreeRadicBiolMed, 1991,11(1):81-128.

(編輯：侯向輝)

Hepatoprotective Effects of Abscisic Acid on Acute Liver Injury Induced by CCl4in Mice

LI Hui-ping1,DING Chuan-bo1, XU Xiao-hua2,ZHENG Yi-nan1, LI Ying1, GAO Ming-tong1, LI Jing-yu1, LIU Yi-tong1, ZENG Lu-lu1,LIU Feng2*,LIU Wen-cong1*
(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.China-JapanFriendshipHospitalAffiliatedJilinUniversity,Changchun130031,China)

The aim is to study the protective effects of ABA on acute liver injury induced by CCl4in mice. Seventy male ICR mice were randomly divided into seven groups: normal control group, vehicle control group, model control group, bife- ndate control group, three different dose of ABA groups consisting of high-dosage group, middle-dosage group and low-dosage group(80,40,20 mg/kg). Each group contained ten mice. All of the groups were administered by IG for 10 days. All groups were given CCl4(10%CCl4in olive oil, i.p.) by body weight, expect normal control group and vehicle control group given olive oil after 1 h at the last administration. After 6 hours, animals were sacrificed by bleeding and blood was collected. The levels of ala- nine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high density lipoprotein cholesterol(HDL-c) were determined in serum and and superoxide dismutase(SOD) activities, malondialdehyde(MDA), GSH- Px contents in liver tissues were determined. The liver pathological changs were observed. The ABA can improved significantly the dyslipidemia caused by CCl4- induced acute liver injury in mice. A certain extent of ABA effectively decreased the levels of ALT and AST in serum and contents of MDA, increased SOD, glutathion peroxidase (GSH-Px) activities in liver. The pathological changes were relieved. ABA has a significantly hepatoprotective effect on CCl4-induced acute liver injury in mice. Protective effect of ABA on the liver may be related to its function of improving the dyslipidemia, scavenging free radicals and inhibiting lipid peroxidation, reduceing the pathological changes.

abscisic acid; carbon tetrachloride; liver injury; hepatoprotective effect

李慧萍，碩士生，從事天然藥物研究與開發。

劉文叢，E-mail:jwlw6803@126.com；劉 峰，E-mail:jdliufeng@163.com。

2016-09-05

A

1002-1280 (2017) 02-0064-06

S852.32