產高光學純度L-乳酸菌株HY-38發酵培養基優化

李秀康，徐慧，劉建軍,*

(1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.山東省食品發酵工業研究設計院，山東濟南250013）

產高光學純度L-乳酸菌株HY-38發酵培養基優化

李秀康1，徐慧2，劉建軍1,2*

(1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.山東省食品發酵工業研究設計院，山東濟南250013）

以產L-乳酸光學純度為99.3%的糞腸球菌（Enterococcus faecium）HY-38作為出發菌株，通過Plackett-Burman試驗設計確定影響L-乳酸的產量的主要因素，篩選出3個有顯著影響效應的因素，分別為葡萄糖、酵母膏及乙酸鈉，最陡爬坡試驗逼近影響因素最佳值區域，采用Box-Behnken設計及響應面分析對L-乳酸發酵培養基成分進行優化。結果表明，L-乳酸發酵培養基成分確定為葡萄糖148 g/L、酵母膏12.4 g/L、碳酸鈣80 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸鎂1.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L，在此條件下，L-乳酸的產量達到134.7g/L，比優化前（108.3 g/L）提高了24.3%。

L-乳酸；發酵優化；響應面法

乳酸（2-羥基丙酸）是一種簡單且重要的有機酸，廣泛應用于食品、醫藥、輕紡、化工和環保等領域[1]。在食品行業，乳酸主要用于酸奶和奶酪的生產以及食品防腐[2]。乳酸的構型可以分為L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸[3]，由于人和動物體內只有代謝L-乳酸的酶，攝入過量D-乳酸會引起代謝紊亂甚至酸中毒[4]，因此，與消旋的DL-乳酸相比，高光學純度的L-乳酸具有更高的工業價值[5]。

據估計，乳酸的需求量以每年5%～8%的速率增長[6]，預計到2017年，食品安全級的L-乳酸需求量將達到376300t，遠遠超出了目前的供給能力[7-8]，全世界絕大部分乳酸的生產是通過微生物發酵合成的，乳酸生物合成的關鍵是同型發酵細菌[9]，迄今為止，對以乳桿菌屬為代表的多種屬的細菌的研究取得了一些進展，對于腸道細菌發酵乳酸的研究較少，且產量較高的菌株L-乳酸的光學純度不高，產品品質相對較低。本實驗室多年來一直開展L-乳酸的研究，從牛瘤胃內容物中篩選出一株高產L-乳酸且光學純度為99.3%的糞腸球菌（Enterococcus faecium）HY-38菌株。本研究在前期培養基單因素優化的基礎上，采用Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗及Box-Behnken試驗對E.faeciumHY-38菌株產L-乳酸的發酵培養基進行優化，進一步提高L-乳酸的產量，以期為其工業化生產高光學純度L-乳酸提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

糞腸球菌（Enterococcus faecium）HY-38：由山東省食品發酵工程重點實驗室篩選保存。

1.1.2 培養基

斜面培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏4 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂1 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏4 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂1 g/L，碳酸鈣10 g/L。

基礎發酵培養基：葡萄糖120 g/L，酵母膏8 g/L，乙酸鈉3 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂1 g/L，硫酸錳0.1 g/L，碳酸鈣70 g/L（碳酸鈣與其他成分分開滅菌，在無菌條件下加入培養基），pH自然。

以上所有培養基均在121℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 主要化學試劑

葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；碳酸鈣（分析純）：天津市廣成化學試劑有限公司；磷酸二氫鈣、硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；L-/D-乳酸檢測試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；L-乳酸標準品（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）、UltiMate 3000系列VWD-3000可變波長檢測器：戴安（中國）有限公司；Prontosil1202102 C18色譜柱(10 μm，4.6 mm×250 mm)：美國Thermo公司；Anke TDL-5-A臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；722可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；JY2002天平：上海精密科學儀器有限公司；UB-10pH計：丹佛儀器（北京）有限公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

種子培養：從斜面培養基上挑取一環活化好的菌體HY-38接種到種子培養基（裝液量為60 mL/250 mL）中，在37℃恒溫培養箱中100 r/min振蕩培養10 h。

搖瓶培養：將種齡為10 h的種子液按5%的接種量加入到發酵培養基（裝液量為60 mL/250 mL）中，在37℃恒溫培養箱中100 r/min振蕩培養72 h。

1.3.2L-乳酸含量測定及L-乳酸標準曲線的測定

發酵液經12 000 r/min離心10 min除去菌體和多余的碳酸鈣，取100 μL上清液稀釋20倍，以0.22 μm微孔濾器過濾即為待測液。

采用高效液相色譜法測定發酵液中L-乳酸含量。色譜條件為：色譜柱為Prontosil 1202102 C18柱（10 μm，4.6 mm× 250 mm)；UltiMate 3000系列VWD-3000可變波長檢測器；流動相0.1 mol/L KH2PO4，磷酸調節pH至2.5；進樣體積為20μL；流速為0.5mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為30℃。

取0.250 gL-乳酸標準品充分溶解定容至25 mL的容量瓶中，分別吸取2mL、4mL、6mL、8mL定容于10mL容量瓶中，制得質量濃度梯度為2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的L-乳酸標準溶液。標準曲線回歸方程為Y=12.71X－0.378（R2=0.999 9）。

1.3.3 L-乳酸光學純度測定

利用L-/D-乳酸檢測試劑盒測定乳酸的光學純度。L-乳酸的光學純度的計算公式如下：

1.3.4 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman設計是一種經濟而有效的2水平試驗方法，可以較少的試驗快速地從眾多影響因素中篩選出顯著影響因素[10-11]。本試驗在前期單因素試驗的基礎上，選用N=12的Plackett-Burman設計，選取葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳7個因素進行考察，用Minitab 16軟件對試驗數據進行處理，以L-乳酸產量（Y）為響應值，Plackett-Burman試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.5 最陡爬坡試驗

響應面擬合方程只有在考察的鄰域里才充分近似真實情形，首先要逼近最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程[12]。通過Plackett-Burman試驗設計結果篩選出顯著影響因素，根據效應的大小設定步長及變化方向，以快速逼近最佳區域[13]，而其他非顯著因素的取值則根據各因素效應的正負來確定，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。找到L-乳酸產量最高的培養基方案，作為響應面分析的中心點，確定最大響應值的區域。

1.3.6 響應面分析試驗方法

表2 Box-behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-behnken experiments

通過Plackett-Burman試驗確定3個顯著因素，最陡爬坡試驗確定了3個顯著因素響應區域的中心點，從3個顯著因素的響應區域各取3水平[14]，根據Box-Behnken試驗的中心組合設計原理，用Minitab16軟件設計Box-Behnken試驗[15-16]并進行數據分析，Box-Behnken試驗因素與水平見表2。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman設計及結果分析

按Plackett-Burman設計進行試驗，每組進行3次平行試驗，搖瓶發酵72 h，以L-乳酸產量為響應值，結果取3次的平均值。Plackett-Burman試驗設計及結果見表3，各因素效應及顯著性分析見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experimental design

表4 Plackett-Burman試驗顯著因子分析Table 4 Analysis of significant factors of Plackett-Burman experiments

由表4可知，葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣、乙酸鈉、硫酸鎂對L-乳酸產量表現為正效應，磷酸二氫鉀和硫酸錳對L-乳酸產量表現為負效應。其中葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉，表示其對L-乳酸產量有顯著性影響（P＜0.05），由P值的大小可知，發酵培養基中葡萄糖添加量對L-乳酸影響最大，其次為酵母膏添加量和乙酸鈉添加量。而碳酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳對L-乳酸產量影響不顯著。因此確定葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉為主要影響因素進行下一步試驗。

2.2 最陡爬坡試驗設計及結果

根據Plackett-Burman設計分析結果，葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉表現為顯著正效應，所以最陡爬坡試驗設計沿葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉添加量增大的方向移動。顯著因素的變化步長及方向的最陡爬坡試驗設計及結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of steepest ascent path experiments

由表5可知，第3組L-乳酸的產量最高，即葡萄糖150g/L，酵母膏12 g/L，乙酸鈉5 g/L時，L-乳酸產量為133.3 g/L，因此選擇第3組的水平作為響應面設計的中心點，即葡萄糖150 g/L，酵母膏12 g/L，乙酸鈉5 g/L。

2.3 Box-Behnken試驗設計及響應面試驗分析

通過最陡爬坡試驗確定了葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉的最佳添加量范圍，以L-乳酸產量（Y）為響應值。依據Box-Behnken試驗的中心組合設計原理，在顯著因素的響應區取3個水平，利用Minitab 16軟件設計3因素3水平的響應面試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

利用軟件Minitab 16對表6數據結果進行回歸分析，獲得葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉的二次回歸方程為：

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，因素A、B、A2、B2和D2的影響達到顯著水平（P＜0.05），而因素D、AB、AD、BD的影響未達到顯著水平（P＞0.05），說明在試驗設計范圍內，葡萄糖和酵母膏對L-乳酸產量影響顯著，乙酸鈉影響不顯著。模型P＜0.001，失擬項P值為0.402 4＞0.05，表明該方程模型回歸顯著，失擬不顯著，試驗方法可行。該模型的決定系數R2=0.995 5，調整決定系數R2Adj=0.987 3，說明回歸方程的擬合程度較好，通過該方程得到的預測值與實測值之間有較高的相關性，可以用于L-乳酸產量的理論預測。

2.4 最佳培養基濃度的預測與驗證

利用軟件Design-Expert繪制各因素交互作用的響應曲面及等高線，確定葡萄糖、酵母膏及乙酸鈉添加量對E.faeciumHY-38產L-乳酸的影響，響應面和等高線見圖1。

由圖1可知，隨著葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉的添加量的增加L-乳酸產量都出現先增大后減小的趨勢，其中葡萄糖對L-乳酸產量影響最大，乙酸鈉對L-乳酸產量影響最小。葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉在試驗范圍水平內交互作用不顯著，三個響應面都呈拋物面狀，說明有極值點。為了進一步求證最佳值，對回歸方程分別求一階偏導得到發酵培養基最佳成分為：葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉的添加量分別為148.3 g/L、12.37 g/L、4.95 g/L，在此條件下，L-乳酸產量的預測為133.7 g/L。為了驗證建立的模型與實驗結果是否相符，同時考慮到實際操作的可行性，將培養基成分調整為葡萄糖148 g/L，酵母膏12.4 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，進行3組平行試驗，得到L-乳酸的平均產量為134.7 g/L，與預測值接近，比優化前（108.3 g/L）提高了24.3%，進一步說明響應面法優化E.faeciumHY-38產L-乳酸最佳培養基成分是可行的。

圖1 葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉交互作用對L-乳酸產量影響的響應面和等高線Fig.1 Response surface plots an contour line of effects of interaction between glucose,yeast extract and sodium acetate on L-lactic acid yield

2.5 L-乳酸光學純度檢測結果

E.faeciumHY-38在最佳培養基條件下進行發酵培養，所得的L-乳酸通過試劑盒檢測，L-乳酸光學純度純度為99.3%，說明該培養基條件對L-乳酸的光學純度無影響。E.faeciumHY-38所產L-乳酸的光學純度高于MOON S K等[17]報道的野生型乳酸菌所產的L-乳酸光學純度（96.6%）和NGUYENCM等[18]研究的干酪乳桿菌LactobacillusparacaseiLA104所產的L-乳酸的光學純度（97.3%）。

3 結論

本研究通過Plackett-Burman試驗設計，得到葡萄糖、酵母膏和乙酸鈉是影響E.faeciumHY-38菌株產L-乳酸的主要因素，通過最陡爬坡試驗，獲得了3個主要因素響應區域的中心點，為進行響應面分析確立了變化區間。采用Box-Behnken試驗設計，得到搖瓶發酵產L-乳酸的最佳培養基配方為：葡萄糖148g/L、酵母膏12.4g/L、碳酸鈣80 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸鎂1.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L，經發酵培養后L-乳酸的產量達到134.7 g/L，與回歸方程的預測值很接近，說明得到的模型可靠，比優化前（108.3 g/L）提高了24.3%，說明了響應面試驗的有效性，且該菌種在優化培養基中進行發酵培養后，所產的L-乳酸光學純度仍為99.3%，為其工業化生產高光學純度L-乳酸提供了理論基礎。

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Optimization of fermentation medium for high optical purityL-lactic acid production by strain HY-38

LI Xiukang1,XU Hui2,LIU Jianjun1,2*
(1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China;2.Shandong Food& Fermentation Industry Research&Design Institute,Jinan 250013,China)

Using theEnterococcus faeciumHY-38 with 99.3%optical purity L-lactic acid as original strain,the main factors influencing the L-lactic acid yield were determined by Plackett-Burman experiments.The three factors with significant effect were screened,including glucose,yeast extract and sodium acetate,and optimum value of the main factors were determined steepest ascent path experiments.The results showed that the optimum components of L-lactic acid fermentation medium were as followed：glucose 148 g/L,yeast extract 12.4 g/L,CaCO380 g/L,sodium acetate 5.0 g/L, KH2PO41.0 g/L,MgSO41.2 g/L and MnSO40.04 g/L.Under the conditions,the yield of L-lactic acid could reach 134.7 g/L,which was 24.3%higher than that of before optimization(108.3 g/L).

L-lactic acid;fermentation optimization;response surface methodology

Q815

0254-5071（2017）02-0030-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.007

2016-11-24

泰山學者建設工程專項(NO.ts20130919)

李秀康(1991-)，男，碩士研究生，研究方向為工業微生物。

*通訊作者：劉建軍(1962-)，男，研究員，博士，研究方向為微生物資源利用。