產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的應(yīng)用

王曉丹，雷安亮，王婧，班世棟，邱樹毅*

(1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州遵義387000）

產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的應(yīng)用

王曉丹1,2，雷安亮1,3，王婧1,2，班世棟1,2，邱樹毅1,2*

(1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州遵義387000）

利用高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）提高粹沙酒醬香風(fēng)格特征。將地衣芽孢桿菌FBKL1.0199添加到窖池中層的糟醅中，與空白糟醅作對(duì)比，按照粹沙工藝制酒取樣，考察了不同菌株添加量對(duì)白酒中四甲基吡嗪含量的影響，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)酒醅及酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行感官評(píng)定。結(jié)果表明，最佳菌株添加量為5%，發(fā)酵后的酒醅四甲基吡嗪含量達(dá)6.81 μg/g，是對(duì)照組的3.03倍。酒樣中四甲基吡嗪相對(duì)百分含量達(dá)0.028%，且感官品質(zhì)優(yōu)于對(duì)照組，具有入口醇厚、柔和、醬味且口感細(xì)膩的特征。

地衣芽孢桿菌；四甲基吡嗪；粹沙酒

粹沙酒為丟糟酒的一種，是利用白酒丟糟加入粉碎的高粱、適量的糖化酶以及麩曲再入池發(fā)酵一個(gè)月后蒸餾所得的酒。此工藝提高了淀粉利用率，所得的酒產(chǎn)量高但酒的品質(zhì)較差，醬味不突出。但粹沙酒因價(jià)格較低，受到普通消費(fèi)者的青睞，有一定的市場(chǎng)。四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TTMP）又稱川芎嗪，是白酒的重要香氣成分，曾被人誤解為美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，后經(jīng)江南大學(xué)研究證實(shí)該化合物是由功能菌株轉(zhuǎn)化前體物質(zhì)乙偶姻生成[1]。嗜熱芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）以及地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）都有較強(qiáng)的水解淀粉和蛋白質(zhì)的能力，是醬香型酒的風(fēng)格形成的重要菌類[2]。地衣芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科細(xì)菌，為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，已經(jīng)證實(shí)具有生產(chǎn)醬味的能力。張榮等[3]從高溫大曲中分離得到了三株產(chǎn)醬香的菌，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液在6 d后呈現(xiàn)明顯的醬香，并在發(fā)酵液中檢測(cè)到了乙偶姻、四甲基吡嗪以及呋喃扭爾。針對(duì)白酒醬味不突出進(jìn)行了一系列的研究，主要是使用強(qiáng)化大曲，利用功能菌提高四甲基吡嗪產(chǎn)量。ZHU B F等[4]對(duì)從高溫大曲分離得到的利用乙偶姻產(chǎn)四甲基吡嗪的厭氧芽孢桿菌進(jìn)行了研究，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，同時(shí)對(duì)該菌產(chǎn)四甲基吡嗪的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到＞4.08 g/L的目標(biāo)產(chǎn)物。該實(shí)驗(yàn)組還對(duì)銨鹽對(duì)四甲基吡嗪的積累影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)高濃度的磷酸氫二銨有利于四甲基吡嗪的產(chǎn)生，依此制定了發(fā)酵過(guò)程中銨鹽的補(bǔ)給策略，將四甲基吡嗪的發(fā)酵罐產(chǎn)量提高了29%[5]。另外，該實(shí)驗(yàn)組還考察了不同初始pH對(duì)菌體產(chǎn)四甲基吡嗪的影響，發(fā)現(xiàn)弱酸環(huán)境有利于前體物質(zhì)乙偶姻的積累，中性環(huán)境有利于四甲基吡嗪的生成，依此制定了兩階段pH控制策略以提高四甲基吡嗪的產(chǎn)量[6]。朱兵峰[7]建立了一種全細(xì)胞多步轉(zhuǎn)化乙偶姻偶聯(lián)四甲基吡嗪化學(xué)合成的工藝，在前體乙偶姻濃度達(dá)到41.4 g/L時(shí)控制反應(yīng)條件為四甲基吡嗪最優(yōu)合成條件，由此可得16.5 g/L四甲基吡嗪。趙德義等[8]從中溫大曲中分離得到一株高產(chǎn)四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌，并研究了如何提高產(chǎn)物的純度。此外，凌杰等[9]研究了醬香型白酒釀造過(guò)程中酵母與地衣芽孢桿菌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母通過(guò)產(chǎn)酸以及大分子的蛋白質(zhì)物質(zhì)對(duì)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)形成抑制，促進(jìn)了白酒釀造群體微生物發(fā)酵過(guò)程的解析。豐貴鵬等[10-11]分別研究了地衣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，使發(fā)酵周期縮短了10 h，而且活菌數(shù)達(dá)到每個(gè)單位接近1×108；優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵完成后芽孢數(shù)可以達(dá)到1.25×1011CFU/mL。本研究利用從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌FBKL1.0199添加到糟醅中再入池發(fā)酵一個(gè)月，以提高粹沙酒的品質(zhì)，同時(shí)考察了不同接種量對(duì)酒的品質(zhì)影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用菌株為從醬香大曲中篩選出的地衣芽孢桿菌FBKL 1.0199；所用酒醅、麩曲及糖化酶均來(lái)源于貴州省珍酒釀酒有限公司。

其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

StableFlex纖維頭（DVB/CAR/PDMS）、57330-U手動(dòng)萃取手柄：美國(guó)Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司；FA1004電子天平：上海箐海儀器有限公司；TDL-5低速離心機(jī)：南京東邁科技儀器有限公司；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。1.3方法

1.3.1 丟糟續(xù)糧入池發(fā)酵

粹沙窖池開窖取酒后，按照粹沙工藝加入一定量的新糧、糖化酶和麩曲，攪拌均勻，將制備好的菌懸液分別按0.1%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%的接種比例分別接種到5 kg酒醅中，將接種好的酒醅裝入編織袋內(nèi)，置于窖池中上層，以不接入功能性菌株的酒醅作為對(duì)照組，用窖泥封窖。發(fā)酵30 d后開窖取醅，開窖后立即測(cè)定酒醅的蛋白質(zhì)含量和四甲基吡嗪含量。將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組酒醅分別上甑蒸餾，對(duì)蒸餾得到的酒樣進(jìn)行頂空固相萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合GC-MS分析。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法測(cè)定[12]。

1.3.3 酒醅及酒樣中四甲基吡嗪含量測(cè)定

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）技術(shù)結(jié)合GC-MS分析酒醅中揮發(fā)性成分及吡嗪類物質(zhì)的含量。

樣品處理：取酒醅15 g，研磨充分后加入30 mL蒸餾水浸泡10 min，然后超聲波處理30 min，取出離心或過(guò)濾，吸取上清液5 mL于15 mL萃取瓶中，加入1.5 g NaCl（酒樣則直接取5mL于15mL萃取瓶中，不加NaCl）。插入裝有2cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60℃左右頂空萃取40 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中，熱解吸3 min進(jìn)樣。采用全掃描模式對(duì)酒樣中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)。

氣相色譜條件：色譜柱CP-WAX（30 m×0.25 mm× 0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫35℃（保持5 min），以4℃/min升溫至135℃，再以8℃/min升溫至180℃保持5min，運(yùn)行時(shí)間43 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦（He）（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流速0.8 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為20：1；溶劑延遲時(shí)間2 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），離子源溫度230℃，接口溫度250℃。

定性定量方法：采用選擇離子掃描模式對(duì)四甲基吡嗪的四個(gè)特征離子進(jìn)行掃描。根據(jù)峰面積與含量成正比的關(guān)系，用GC-MS聯(lián)用儀計(jì)算其峰面積對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值，根據(jù)已建立的四甲基吡嗪響應(yīng)值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到酒醅及酒樣中四甲基吡嗪含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)酒醅四甲基吡嗪和蛋白質(zhì)含量的影響

實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵前后酒醅中四甲基吡嗪和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)組酒醅中殘留蛋白質(zhì)含量隨接種量的增大總體呈下降趨勢(shì)，其含量基本低于對(duì)照組但減少量不大，這可能與加入的功能性菌株，其自身生長(zhǎng)消耗及代謝利用部分蛋白質(zhì)將其轉(zhuǎn)化成四甲基吡嗪有關(guān)。地衣芽孢桿菌桿菌能產(chǎn)生中性蛋白酶與其他微生物產(chǎn)生的酸性蛋白酶協(xié)同作用，能降解復(fù)雜蛋白質(zhì)，對(duì)提高出酒率及酒的品質(zhì)有一定作用[13]。發(fā)酵前酒醅中沒(méi)有檢測(cè)到四甲基吡嗪。發(fā)酵后對(duì)照組的四甲基吡嗪含量最低為2.25 μg/g，接種量為5%的實(shí)驗(yàn)組其四甲基吡嗪含量最高，達(dá)6.81μg/g，是對(duì)照組的3.03倍。其次為10%接種量的實(shí)驗(yàn)組，含量為6.54 μg/g。因此選擇接種量為5%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。黃永光等[14-15]利用黑曲霉分泌的蛋白酶處理發(fā)酵培養(yǎng)基，所得樣品與對(duì)照組相比，不僅產(chǎn)酒率得到了提高，香味物質(zhì)也得到了加強(qiáng)，所得樣品四甲基吡嗪含量是對(duì)照組的3倍多，這與本研究結(jié)果相同，也充分說(shuō)明蛋白質(zhì)對(duì)香味物質(zhì)的貢獻(xiàn)。

2.2 酒樣中四甲基吡嗪分析

對(duì)照組（接種量0）、實(shí)驗(yàn)組（接種量5%）酒樣GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。成分分析見(jiàn)表1、表2。

圖2 對(duì)照組(A)及實(shí)驗(yàn)組(B)酒樣中揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components in control group (A)and experimental group(B)liquor analysis by GC-MS

由表1可知，對(duì)照組酒樣中共檢測(cè)到48種物質(zhì)，醛類物質(zhì)4種，酮類物質(zhì)3種，醇類物質(zhì)10種，酸類物質(zhì)1種，酯類22種，其他芳香及雜環(huán)類物質(zhì)8種。其中乙酸乙酯相對(duì)含量最高，沒(méi)有檢測(cè)到吡嗪類物質(zhì)。

由表2可知，實(shí)驗(yàn)組酒樣中共檢測(cè)到50種物質(zhì)，醛類物質(zhì)5種，酮類物質(zhì)3種，醇類物質(zhì)10種，酸類物質(zhì)3種，酯類24種，其他芳香及雜環(huán)類物質(zhì)9種。含量最多的是乙酸乙酯，相對(duì)百分含量為38.665%，檢測(cè)到具有代表性醬香風(fēng)味的物質(zhì)有糠醛、吡嗪和糠醇等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對(duì)百分含量為0.028%。

表1 對(duì)照組酒樣揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 Composition analysis of aroma components in control group liquor by GC-MS

表2 實(shí)驗(yàn)組酒樣揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 Composition analysis of aroma components in experimental group liquor by analysis GC-MS

3 結(jié)論

本研究從高溫大曲分離得到的地衣芽孢桿菌直接添加到糟醅，再入窖發(fā)酵，所得酒樣中風(fēng)味物質(zhì)—四甲基吡嗪含量得到明顯提高。同時(shí)考察了不同接種量對(duì)酒醅的影響，發(fā)現(xiàn)接種量為5%時(shí)最佳，所得酒醅中四甲基吡嗪含量較高，是對(duì)照組的3.03倍；揮發(fā)性成分與對(duì)照組有明顯的不同：添加地衣芽孢桿菌發(fā)酵制得的酒樣中除苯甲醛和糠醛含量稍有降低外，醛類物質(zhì)特別是乙縮醛含量上升明顯；比對(duì)照組酒樣多了一種香味物質(zhì)4-羥基-2-丁酮，且乙偶姻的含量相對(duì)少，可能是產(chǎn)生了更多的四甲基吡嗪；大部分醇類種類上相同，含量上差別也不顯著；變化最大的應(yīng)該是酯類物質(zhì)的種類，除乙酸乙酯的含量變化較大外，其余酯類含量差別并不明顯。檢測(cè)到具有代表性醬香風(fēng)味的物質(zhì)有糠醛、吡嗪和糠醇等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對(duì)百分含量為0.028%。

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Application ofBacillus licheniformiswith tetramethyl pyrazine yield

WANG Xiaodan1,2,LEI Anliang1,3,WANG Jing1,2,BAN Shidong1,2,QIU Shuyi1,2*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor-Making and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Jane Wine Brewing Co.,Ltd., Zunyi 387000,China)

Bacillus licheniformisisolated from high-temperatureDaquwas used to improve Moutai-flavor style of Cuisha liquor.Comparing with the control group of fermented grains,B.licheniformis(FBKL1.0199)was added into the fermented grains lied in the middle layer of the pits.Samples were taken according to the liquor-making technology,and the effect of different strains addition on tetramethyl pyrazine content was investigated. Volatile components in distilled grains and liquor were analyzed using GC-MS.Meanwhile,sensory evaluation of the sample was made.Results showed that the optimum strain addition was 5%,the tetramethyl pyrazine content in fermented grains was 6.81 μg/g after fermentation,which was 3.03 times of the control group.The relative percentage of tetramethyl pyrazine in the liquor reached 0.028%,and the sensory quality was mellow, soft,with sauce flavor and delicate features,which was better than the control group.

Bacillus licheniformis;tetramethyl pyrazine;Cuisha liquor

TS261.1

0254-5071（2017）02-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.008

2016-12-21

貴州省科技支撐項(xiàng)目（黔科合支撐[2016]2340）；貴州省科技廳重大專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6012)；貴州省科技廳工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省科技廳重大專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字[2013]6009號(hào)）；貴州省省校合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字[2014]7672）

王曉丹（1980-），女，工程師，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。

*通訊作者：邱樹毅（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。