茅臺地區醬香型酒糟中高溫真菌的分離鑒定

任勰珂，陳莉,3*，盧紅梅,3，周蓮，賈青慧，白成松

茅臺地區醬香型酒糟中高溫真菌的分離鑒定

任勰珂1，陳莉1,3*，盧紅梅1,3，周蓮2，賈青慧2，白成松1

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025；3.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025）

從茅臺地區醬香型酒糟中分離篩選出4株耐高溫真菌M1、M4、M5以及M6。對各菌株的降解特性研究表明：菌株M4有一定的淀粉和蛋白質分解能力；菌株M5纖維素分解能力較強，55℃時其Hc值能達到3.21，有一定的淀粉分解能力；菌株M1、M6有一定的淀粉、纖維素和蛋白質分解能力。通過篩選菌株的細胞形態、菌落形態、ITS序列分析以及系統發育分析，鑒定菌株M1是微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、菌株M4是嗜熱籃狀菌（Talaromyces thermophilus）、菌株M5是黑曲霉（Aspergillus niger）、菌株M6是腫梗根毛霉（Rhizomucor tauricus）。

醬香型酒糟；高溫真菌；分離鑒定；ITS序列分析

酒糟別名紅糟、粕等，是米、麥、高梁等釀酒后剩余的殘渣。我國酒糟的綜合利用能力較低，主要應用于生產飼料、有機肥等[1]。貴州省作為醬香型白酒主產區之一，每年產生近百萬噸的白酒酒糟，廢棄酒糟量巨大且極易發生霉變，若不及時處理就會造成資源浪費、環境污染。如何高效、經濟、環保地綜合利用酒糟逐漸成為人們所關注的焦點。目前，白酒生產過程中酒糟資源化利用的問題成為我國白酒產業快速發展所面臨的主要障礙[2]。高溫菌是一類能在45℃以上生長和繁殖的嗜熱微生物，降解性能好、代謝效率高，在很多領域都發揮著重要的作用[3]。若將菌株引入到酒糟中，可生產動物飼料及生物有機肥。這既能很好地解決對環境的污染問題，又帶來了一定的經濟效益，由此可見，發展酒糟的綜合利用值得大力推廣[4-5]。本實驗從茅臺地區醬香型白酒酒糟中篩選出耐高溫真菌，通過對其進行相關特性研究，以期為后續高溫菌劑的制備及生物有機肥的生產奠定基礎，這對于加強酒糟的資源化利用，促進白酒產業的持續發展都將具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

酒糟：取自茅臺鎮第七輪次拋糟的醬香型白酒酒糟。

1.1.2 試劑

無水乙醇（分析純）、體積分數為95%乙醇：大津市富宇精細化工有限公司；可溶性淀粉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）：天津市光復精細化工研究所；番紅O（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；高蛋白脫脂高鈣奶粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；剛果紅：天津市科密歐化學試劑有限公司；盧戈氏碘液：I 1 g，KI 2 g，去離子水300 mL，先用少量去離子水溶解KI，再將I加入其中溶解完全，最后補水至300 mL。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH 5.8～6.2，121℃滅菌20 min。

纖維素培養基：羧甲基纖維素鈉2 g，（NH4）2SO41 g，KH2PO41 g，酵母膏1 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，CaCl20.25 g，去離子水1 000 mL，pH自然，115℃滅菌30 min。

淀粉培養基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH自然，120℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DMS-653生物數碼顯微鏡：深圳市博宇儀器有限公司；SPX-250B智能型生化培養箱、DHG-9140B（101-2B）智能型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海瑯殲實驗設備有限公司；YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽滅菌器、SN-CJ-IF潔凈工作臺：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FlexCycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Analytik Jena公司；BIORAD水平電泳系統：美國Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒糟中高溫真菌的分離篩選及形態觀察

將酒糟制成不同稀釋梯度的菌液均勻涂布在PDA培養基上，55℃倒置培養24 h。仔細觀察菌落特征及個體形態，將不同特征、生長良好的單個菌落用無菌接種針挑出，在PDA培養基上劃線培養，經過7～8次得到純種高溫菌。

形態觀察：將分離純化的菌株劃線接種在相應的培養基上，55℃培養12～72 h[6]，觀察菌落特征；將篩選出的菌株分離純化后采用透明膠帶法，于光學顯微鏡下觀察個體形態。

1.3.2 酒糟中高溫真菌的生長特性研究

最適生長溫度的測定：將霉菌在PDA平板上活化，挑取長勢相同的小菌落接種在PDA平板上，分別置于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的恒溫生化培養箱中培養3 d，每個溫度條件下培養3組，用十字交叉法測定菌落大小，取平均值，并繪制各菌株的生長溫度測量曲線。

生長曲線的繪制：將霉菌接種到PDA試管斜面上，在50℃，濕度90%的恒溫恒濕箱中培養3 d，待孢子豐富后，用移液器向試管中加入10 mL的無菌生理鹽水，充分搖勻后，吸取0.1 mL的孢子懸液接種到裝有100 mL改良馬丁培養基的250 mL三角瓶中，每種菌株做3組，50℃、120 r/min條件下搖床培養，每隔1 d將三角瓶取出置于冰箱中保存，共測5 d，待全部培養結束后，依次將培養液用真空泵抽濾于定量濾紙上，在100℃條件下烘箱烘至質量恒定后，電子天平稱量與之前定量濾紙的質量差為菌體干質量，求出平均值，繪制霉菌的生長曲線圖。

1.3.3 酒糟中高溫真菌的降解特性研究

菌株的淀粉降解特性試驗：（1）配制淀粉培養基，待平板凝固后放在55℃培養箱中過夜；（2）在平板上接種待測菌株后，分別在50℃和55℃的條件下培養3 d，每個溫度條件設置3個平板，培養結束后在平板上滴加盧戈氏碘液，觀察記錄透明圈大小，根據透明圈的大小和其菌落直徑的比值（Hc值）判斷微生物分解淀粉能力的強弱[7]。

菌株的纖維素降解特性試驗：（1）配制纖維素降解培養基，倒平板，待凝固后放在55℃培養箱中過夜；（2）在平板上接種待測菌株后，分別在50℃和55℃的條件下培養3d，每個溫度條件設置3個平板，待培養時間結束后，將1 g/L的剛果紅溶液倒入平板中沒過培養基，浸泡30 min，再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡30 min，觀察記錄透明圈大小，計算Hc值取平均值[8]。

菌株的蛋白質降解特性試驗：（1）每升瓊脂培養基中加入10 g脫脂奶粉，配制蛋白降解培養基。脫脂奶粉真空包裝袋紫外殺菌1 h，與滅菌的瓊脂培養基混合均勻后倒平板，待凝固后放于各菌株最適培養溫度的培養箱中過夜；（2）在平板上穿刺接種待測菌株后，分別在50℃和55℃的條件下培養，每個溫度條件設置3個平板，每隔一段時間觀察一次平板的透明區域，待培養結束后，觀察記錄各平板的總透明范圍，如果微生物菌株能產胞外蛋白酶，則可將脫脂奶粉中的蛋白水解，使菌落周圍的乳黃色褪去[9]。出現透明表示菌株能利用蛋白，為陽性反應（用“+”表示），未出現透明表示菌株不能利用蛋白，為陰性反應（用“-”表示）[10]。

1.3.4 酒糟中高溫真菌的鑒定

霉菌基因組DNA的提取：取少量菌絲用液氮充分研磨后均分置兩個離心管中，加入1 mL抽提緩沖液渦旋混勻。每管加60μL20%的十二烷基磺酸鈉，65℃溫育30min（10min顛倒一次），再加入150μL5mol/LNaCl、130μL十六烷基三甲基溴化銨/NaCl溶液，顛倒混勻，65℃溫育30min（10 min顛倒一次）。將每管分成2管，加等體積的苯酚、氯仿、異戊醇輕輕顛倒混勻10000r/min，4℃離心10min。取上清液加等體積的氯仿，輕輕顛倒混勻后10 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液加1/10體積的3 mol/L NaAC，等體積的異丙醇（預冷）-20℃放置1～2 h，10 000 r/min，4℃離心10min，棄異丙醇，加體積分數為70%乙醇500μL洗兩次，每次洗后都要4℃離心10min，然后室溫干燥。加100μLTE，置于4℃溶解，加8μL核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）A 4℃過夜。加等體積的氯仿顛倒混勻后，4℃、10 000 r/min離心，取上清液-20℃保存。

rDNA ITS區段的PCR擴增及測序：以提取的DNA為模板，通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。所有PCR均在25 μL標準反應體系中進行，反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃復性40 s，72℃延伸1 min，10個循環；最后于72℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，150 V、100 mA、20 min對PCR擴增產物進行檢測[12]。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用小量膠回收試劑盒從含有擴增產物條帶的瓊脂糖凝膠上進行回收、純化，具體操作見試劑盒。純化的后送上海生工公司進行測序，測序結果用Chromas軟件參照正反序列圖譜進行人工校正[13]。

系統發育樹的構建：用BLAST將測序結果在NCBI中與已知霉菌的rDNA ITS區段基因序列進行同源性分析，并用MEGA5.10軟的Neighbor-Joining法構建系統發育樹，具體確定菌株的種屬[14]。

2 結果與分析

2.1 酒糟中高溫真菌的分離及形態觀察

通過實驗分離出四株高溫菌，分別編號為M1、M4、M5、M6，其菌落形態見圖1。

圖1 部分菌株的菌落形態Fig.1 Colonial morphology of part strains

菌落觀察得知，4株菌菌落干燥，M1呈疏松絨毛狀、初期白色后期灰色；M4為疏松棉絮狀、初期白色后期呈淺粉紅色；M5呈松散絨毛狀、初期白色后期呈青綠色；M6呈疏松絨毛狀、初期白色后期灰色。初步觀察后進行顯微鏡鏡檢，結果見圖2。

圖2 部分菌株鏡檢結果（10×40）Fig.2 Microscopy results of part strains(10×40)

由圖2可知，菌株M1菌絲無隔，無假根，有典型孢子囊，孢子量大；菌株M4菌絲有隔，具有掃把狀的分生孢子頭；菌株M5菌絲無隔，無假根，有典型孢子囊，孢子量大；菌株M6菌絲無隔，無假根，有典型孢子囊，孢子量大。根據各菌株培養的不同菌落形態特征和鏡檢圖，配合實驗查找手冊[15]，初步判斷菌株M1為一株毛霉；M4為一株青霉；M5為一株曲霉；M6為一株毛霉。

2.2 酒糟中高溫真菌的生長特性研究

2.2.1 最適生長溫度

四株菌的生長溫度曲線見圖3。由圖3可知，菌株M1的最適生長溫度為45℃，M4的最適生長溫度為50℃，M1、M4在40～55℃均能較好的生長；M5的最適生長溫度為40℃，在35～45℃均能較好的生長；M6的最適生長溫度為40℃，在35～50℃均能較好的生長。因此，可以利用溫度對菌株生產快慢的影響來控制菌落大小、測定不同長勢條件下的有機質分解能力。

2.2.2 生長曲線

圖4 菌株M1(A)、M4(B)、M5(C)和M6(D)的生長曲線Fig.4 Growth curve of strains M1(A)、M4(B)、M5(C)and M6(D)

四株菌的生長曲線見圖4。由圖4可知，四種菌株在培養1 d后均有大量菌體生成，1～3 d菌體干質量快速上升，第3天達到最大值后開始下降，上升和下降趨勢均較緩和。由菌體干質量的變化趨勢可知，菌株M1、M4、M5、M6發酵周期均為3 d。

2.3 酒糟中高溫真菌的降解特性研究

2.3.1 菌株的淀粉降解特性試驗

菌株的淀粉降解實驗結果見表2。由表2可知，每株菌都能產生胞外淀粉酶，對比50℃和55℃條件下的淀粉降解能力可知，在55℃條件下，淀粉降解能力有所提高，尤其以菌株M1、M6的淀粉降解能力提高最為明顯。從這一實驗現象可知，升溫可以提高菌株的淀粉降解能力，通過調節培養溫度可以實現菌株的快速生長和高降解效果的轉變。

表2 菌株的淀粉降解實驗結果統計Table 2 Experimental results of starch degradation of strains

2.3.2 菌株的纖維素降解特性實驗

菌株的纖維素降解實驗結果見表3。由表3可知，僅菌株M4不能產生纖維素分解酶，在55℃培養條件下，菌株M5的生長速度極為緩慢，3 d只能長出很小的菌落。其余菌株雖然纖維素分解能力都較弱，但在纖維素培養基上能較好生長。對比50℃和55℃條件下的纖維素降解能力可知，在55℃條件下纖維素降解能力有所提高。

表3 菌株的纖維素降解實驗結果統計表Table 3 Experimental results of cellulose degradation of strains

2.3.3 菌株的蛋白質降解特性實驗

每隔一段時間對蛋白質降解培養基平板透明區域產生情況進行觀察并記錄，3 d后作出匯總得到表4。由表4可知，僅菌株M5不能產生胞外蛋白酶，菌株M4的蛋白質分解能力較高，菌株M1、M6則較弱。

表4 菌株的蛋白質降解特性實驗結果統計表Table 4 Experimental results of protein degradation characteristics of strains

2.3.4 rDNA ITS序列分析及基因系統發育分析

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測ITS區擴增產物，結果見圖5。

圖5 菌株M1、M4、M5和M6的PCR擴增電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of PCR amplification strains M1,M4,M5 and M6

由圖5可知，發現在500～600 bp處有一明亮條帶，測序結果表明，菌株M1、M4、M5、M6的基因序列長度依次為534 bp、544 bp、557 bp和517 bp，與檢測結果相符合。

將菌株M1、M4、M5、M6的ITS序列測序結果與NCBI中已報道的模式菌株序列進行比對可知，菌株M1、M6與根毛霉屬（Rhizomucor）成員有較高的序列同源性，在86%～99%之間，其中菌株M1、M6與牛根毛霉（Rhizomucor tauricus）和微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）的同源性達到99%，說明菌株M1、M6與這兩個種具有最高的序列同源性；菌株M4與踝節菌屬（Talaromyces）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）成員有較高的序列同源性，在88%～99%之間，其中菌株M4與嗜熱藍狀菌（Talaromyces thermophilus）的同源性到達99%；菌株M5與青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、芬尼菌屬（Fennellia）成員有較高的序列同源性，在96%～99%之間，其中菌株M5與青霉菌（Penicillium malachiteum）、曲霉屬（Aspergillus cervinus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黃柄芬尼菌（Fennellia flavipes）的同源性到達99%。

用MEGA5.10構建的系統發育樹如圖6所示，通過與進化關系比較親近的屬種進行系統發育學分析可知，M1、M6均屬于毛霉屬，M1與毛霉屬中的根毛霉（Rhizomucor pusillus）和絲瓜毛霉（Rhizomucor tauricus）親緣關系最近，三者在同一進化分支上；M6與毛霉屬中的絲瓜毛霉（Rhizomucor tauricus）親緣關系最近，兩者在同一進化分支上；M4屬于青霉屬，M4與青霉屬中的亞屬踝節菌屬中的嗜熱藍狀菌（Talaromyces thermophilus）親緣關系最近，兩者在同一進化分支上；M5屬于曲霉屬，M5與曲霉屬中的黑曲霉（Aspergillus niger）親緣關系最近，兩者在同一進化分支上。結合菌株M1、M4、M5、M6的細胞形態、菌落形態、ITS序列分析以及系統發育分析可以鑒定：菌株M1是微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、菌株M4是嗜熱藍狀菌（Talar-omycesthermophilus）、菌株M5是黑曲霉（Aspergillusniger）、M6是腫梗根毛霉（Rhizomucor tauricus）。

圖6 菌株M1(A)、M4(B)、M5(C)和M6(D)的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain M1(A),M4(B),M5(C)and M6(D)

3 結論

從茅臺菌株地區醬香型酒糟中分離篩選出4株耐高溫菌株M1、M4、M5、M6，它們的最適生長溫度依次為45℃、50℃、55℃、40℃，從降解實驗現象可知，4株菌均可以通過調節培養溫度來實現菌株的快速生長和高降解效果的轉變。其中菌株M1有一定的淀粉、纖維素和蛋白質分解能力，菌株M4有一定的淀粉和蛋白質分解能力，菌株M5纖維素分解能力較強，其55℃時Hc值能達到3.21，有一定的淀粉分解能力，菌株M6有一定的淀粉、纖維素和蛋白質分解能力。結合四種菌株的細胞形態、菌落形態、生理生化特征、ITS序列分析以及系統發育分析可以初步鑒定菌株M1、M4、M5、M6依次為微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、嗜熱藍狀菌（Talaromyces thermophilus）、黑曲霉（Aspergillusniger）、腫梗根毛霉（Rhizomucor tauricus）。

這4種菌株能夠降解淀粉、纖維素和蛋白質，在酒糟中繁殖旺盛，菌株的生產速度和降解效果可依據需要人工調節。若將實驗高溫菌株引入到酒糟中，利用高溫菌產生的耐熱酶加快酒糟成分的降解，可明顯縮短堆肥周期，把酒糟發酵為生物有機肥，有效解決農作物肥料供應問題和酒糟資源化利用的問題。有利于可持續發展和白酒產業體系的構建，對擴大酒糟資源和高溫菌的綜合利用范圍具有積極意義。

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Isolation and identification of thermophilic fungi from Moutai-flavor vinasse in Moutai area

REN Xieke1,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,ZHOU Lian2,JIA Qinghui2,BAI Chengsong1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 5500025,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guiyang 5500025,China)

The thermophilic fungi strains M1,M4,M5 and M6 were isolated and screened from Moutai-flavor vinasse in Moutai region.The degradation characteristics of each strain were studied,and the result showed that strain M4 had a certain ability to decompose starch and protein; strain M5 had a strong ability to decompose cellulose,which had a certain amylolytic ability and the Hc value could reach 3.21 when the temperature was 55℃;strains M1 and M6 both had a certain ability of decomposing starch,cellulose and protein.By cell morphology,colony morphology,ITS sequence analysis and phylogenetic tree analysis,the strains M1,M4,M5,M6 could be identified asRhizomucor pusillus,Talaromyces thermophilus, Aspergillus niger,Rhizomucor tauricus,respectively.

Moutai-flavor vinasse;thermophilic fungi;isolation and identification;ITS sequence analysis

TS261.9

0254-5071（2017）02-0069-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.015

2016-09-29

貴州省科技合作計劃項目（黔科合LH字[2016]7453號）

任勰珂（1992-），女，碩士研究生，研究方向為微生物。

*通訊作者：陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向為微生物。