木薯渣中乳酸菌的分離鑒定及其產(chǎn)酸能力分析

楊承劍，謝芳，梁辛，梁賢威*，李孟偉，李麗莉，彭開屏

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

木薯渣中乳酸菌的分離鑒定及其產(chǎn)酸能力分析

楊承劍，謝芳，梁辛，梁賢威*，李孟偉，李麗莉，彭開屏

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

該研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從自然發(fā)酵木薯渣中分離得到9株菌，通過菌株形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA基因序列分析方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，這9株菌均為乳桿菌屬（Lactobacillussp.），其中菌株Y5、Y13、M14為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌株Y6、Y12、M12為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），菌株Y7為丘狀乳桿菌（Lactobacilluscollinoides），菌株M9為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），菌株M11為類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）；產(chǎn)酸及耐酸試驗(yàn)結(jié)果表明這5種菌均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力及耐酸性，發(fā)酵6 h后發(fā)酵液中pH值可達(dá)4.5以下，其中菌株Y12和M14的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在15 h后其pH值均在3.6以下，可用于木薯渣或其他青貯飼料發(fā)酵劑的研制。

木薯渣；乳酸菌；發(fā)酵；分離；產(chǎn)酸

廣西是中國(guó)木薯生產(chǎn)的主產(chǎn)區(qū)，全區(qū)年產(chǎn)鮮薯250萬～300萬t，木薯經(jīng)深加工后剩余眾多廢渣，如處理不當(dāng)，會(huì)給周圍環(huán)境帶來嚴(yán)重污染問題。木薯渣是一種比較廉價(jià)的農(nóng)作物附產(chǎn)物，含有多種氨基酸和對(duì)動(dòng)物體有益的維生素。廣西是水牛養(yǎng)殖大省，水牛資源豐富，全區(qū)水牛養(yǎng)殖總量達(dá)400多萬頭，把木薯渣作為水牛飼糧來源之一在廣西是一種普遍現(xiàn)象。但木薯渣被用于飼料存在著蛋白質(zhì)含量低、不易貯存和適口性差等缺陷[1-3]。利用接種特定種類微生物來發(fā)酵木薯渣并發(fā)生一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，可改變木薯渣的物理化學(xué)性質(zhì)，從而解決上述缺陷[1-2]。木薯渣自然發(fā)酵過程是一個(gè)復(fù)雜的微生物菌群更替過程，有大量的乳酸菌和酵母菌參與，主要由乳酸菌利用厭氧環(huán)境，迅速生長(zhǎng)產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，從而抑制霉菌等腐敗菌的生長(zhǎng)。乳酸菌在青貯飼料發(fā)酵過程中起主要作用，接種乳酸菌使飼料pH迅速下降，抑制腐敗菌迅速生長(zhǎng)引起的大量蛋白水解[1]，所以篩選優(yōu)良的乳酸菌是木薯渣等青貯飼料化發(fā)酵成功的關(guān)鍵[2]。乳酸菌是促使木薯渣自然發(fā)酵的主要微生物，將其應(yīng)用于飼料的微生物添加劑，可有效調(diào)節(jié)木薯渣內(nèi)微生物區(qū)系，抑制有害菌的繁殖[3]。目前，關(guān)于從各種食品及環(huán)境樣品中分離乳酸菌的報(bào)道較為常見[4-5]，但對(duì)自然堆貯發(fā)酵木薯渣中乳酸菌的分離的研究尚少見。本試驗(yàn)采用菌株形態(tài)、生理生化學(xué)、生物梅里埃分析產(chǎn)品公司（analytic products incorporation，API）細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及16S rDNA基因序列相結(jié)合的方法從自然發(fā)酵的堆貯木薯渣中篩選出繁殖速度快、產(chǎn)酸及耐酸能力強(qiáng)的優(yōu)良乳酸菌并進(jìn)行耐酸特性分析，以期為將其擴(kuò)大培養(yǎng)后發(fā)酵木薯渣、調(diào)控木薯渣發(fā)酵過程、提高木薯渣堆貯發(fā)酵品質(zhì)及后續(xù)制備飼料化乳酸菌發(fā)酵劑提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯渣樣品：廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)。

MRS固體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；M17固體培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東凱環(huán)生物科技公司；API 20 E及API 50 CH細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：法國(guó)生物梅里埃股份有限公司；G1060革蘭氏染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；30%過氧化氫：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉：成都金山化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈣（CaCO3）：西安裕華生物科科技有限公司；葡萄糖：上海依赫生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

尼康ECLIPSE 50i型正置生物顯微鏡：日本Nikon公司；DYCP-31DN DNA型電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FR980型凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司；2720型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；SPX-150型生化培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；HC-2518R型冷凍高速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木薯渣中乳酸菌的分離純化

取混合均勻的木薯渣樣品10 g溶解于90 mL無菌生理鹽水中，在渦旋儀上充分混勻，梯度稀釋成10-1～10-6濃度的樣液。分別取各稀釋度的樣液200 μL，用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于含CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基和M17固體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取肉眼可見、生長(zhǎng)較快、單個(gè)、有溶鈣圈的菌落進(jìn)行劃線，反復(fù)分離、純化，取純化后典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶試驗(yàn)[6-7]。選取革蘭氏染色結(jié)果陽(yáng)性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株，分別接種于滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)12 h，將菌株編號(hào)，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌株的鑒定[6-8]

菌株的形態(tài)及初步鑒定：將純化后的菌落接種于MRS固體培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，在生化顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。同時(shí)進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)試驗(yàn)，考察菌株在不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5）條件下的生長(zhǎng)情況。

菌株生理生化鑒定：采用API 50 CH及API 20 E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)檢測(cè)乳酸菌對(duì)葡萄糖、果糖、棉籽糖等49種不同碳源的發(fā)酵能力。API 50CH鑒定系統(tǒng)專用于乳酸桿菌和相關(guān)菌的鑒定，API 20 E作為API 50CH的補(bǔ)充或球菌的鑒定[9]，具體操作方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行[10]，將培養(yǎng)24 h的API試劑條分別取出讀數(shù)，將結(jié)果輸入API生化分析鑒定系統(tǒng)查詢，即得到菌株的種屬信息，對(duì)符合率＞80%的，可認(rèn)定為該菌株的具體種屬[11]。乳酸菌DNA提取：使用生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，對(duì)菌株DNA進(jìn)行提取，具體操作步驟參照產(chǎn)品說明書。

PCR擴(kuò)增條件：使用康為世紀(jì)2×EsTaqMaster Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×EsTaqMaster Mix 25 μL，正向引物27F（10 μmol/L）1 μL，反向引物1492R（10 μmol/L）1 μL，模板DNA（＜0.5 μg）1 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2 min。將乳酸菌基因PCR擴(kuò)增成功的電泳目的條帶片段回收，送生工生物（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建：運(yùn)用BLAST程序?qū)⑷樗峋拇硇蛄信cGenbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)（http：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast）以尋找相似性最高的已知序列。用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多重比對(duì)，通過Mega 4.0軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次隨即抽樣，計(jì)算自舉值以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹的置信度。

1.3.3 菌株產(chǎn)酸速率測(cè)定

將乳酸菌按5%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃、3 000 r/min搖床培養(yǎng)，每隔3 h檢測(cè)一次各乳酸菌發(fā)酵液的pH值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌株發(fā)酵液pH值為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸速率曲線[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯渣樣品中乳酸菌的菌株形態(tài)、生理生化特征

本試驗(yàn)從木薯渣樣品中共分離出9株乳酸菌（即菌株Y5、Y6、Y7、Y12、Y13、M9、M11、M12、M14），所有菌落均呈圓形，中央隆起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，乳白色，周邊有溶鈣圈。木薯渣樣品中乳酸菌的各菌株形態(tài)及生理生化特征結(jié)果如圖1及表1所示。

圖1 木薯渣中乳酸菌的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of lactic acid bacteria isolated from cassava residues

表1 木薯渣中乳酸菌生理生化特性鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria isolated from cassava residues

由圖1及表1可知，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察，9株乳酸菌在顯微鏡下皆呈長(zhǎng)桿、短桿狀，不運(yùn)動(dòng)。所有菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，在pH 3.5～7.5范圍內(nèi)都能夠生長(zhǎng)良好。

根據(jù)API對(duì)乳酸菌在不同碳源下的發(fā)酵特性可以初步判定菌株種屬，其結(jié)果見表2。由表2可知，與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）相符合的菌株有3株，其符合率為95.2%；與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）相符合的菌株有3株，其符合率為99.1%；與丘狀乳桿菌（Lactobacillus collinoides）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）相符合的菌株各1株，其符合率均＞88%。API鑒定系統(tǒng)可以快速鑒定菌株，較傳統(tǒng)生化試驗(yàn)省時(shí)省力，但僅限于可培養(yǎng)菌的鑒定，對(duì)于非可培養(yǎng)菌的鑒定有一定限制，必須結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)來共同完成。因此，仍需要對(duì)目的菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。

表2 菌株的API鑒定結(jié)果Table 2 3 Identification results of stains by API analysis

2.2 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

將分離到的9株乳酸菌，利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，提取其乳酸菌總基因組，對(duì)基因組進(jìn)行16S rDNA基因PCR擴(kuò)增[9]，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖2。將所得菌株序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast對(duì)比，獲得相似性較高的已知菌序列，然后運(yùn)用Clustalx 1.83、Mega4等軟件，以大腸桿菌（Escherichia coli）（NCBI登錄號(hào)：X80725）為外群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。

圖29 株菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of 16S rDNA PCR amplified products of nine strains

圖3 菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strains

由圖2可知，9株乳酸菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 500 bp左右。與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示最相似已知菌皆為乳桿菌屬（Lactobacillussp.），其中與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）最相似的菌株有3株（Y5、Y13、M14），與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）最相似的菌株有3株（Y6、Y12、M12），與丘狀乳桿菌（Lactobacillus collinoides）最相似的菌株有1株（Y7），與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）最相似的菌株有1株（M9），與類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）最相似的菌株有1株（M11），其相似性均在99%以上。由圖3可知，本試驗(yàn)所分離到的菌株分別位于乳酸菌屬的兩大分支上，但菌株Y6、Y12、M11、Y7及Y5在遺傳距離上與其他已知菌株仍相隔較遠(yuǎn)。

2.4 菌株產(chǎn)酸速率比較

產(chǎn)酸速率與產(chǎn)酸量是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)對(duì)自然發(fā)酵木薯渣堆貯中篩選出的乳酸菌的產(chǎn)酸特性進(jìn)行研究，5種乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)酸速率曲線如圖4所示。

圖45 種菌株產(chǎn)酸速率曲線Fig.4 Acid-producing speed curves of five strains

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，5株乳酸菌發(fā)酵液中pH值逐漸下降，其中0～6 h降低幅度最大，6 h后即可達(dá)到pH 4.0～4.5，然后逐漸趨于平緩。除菌株M11外，其余的pH在15 h后均下降到4.0以下，其中菌株Y12和M14的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在發(fā)酵15 h后，其pH值分別達(dá)到3.50和3.57。所分離的乳酸菌的產(chǎn)酸能力由強(qiáng)至弱的順序?yàn)椋壕闥12（植物乳桿菌）＞菌株M14（干酪乳桿菌）＞菌株Y7（丘狀乳桿菌）＞菌株M9（副干酪乳桿菌）＞菌株M11（類布氏乳桿菌）。MCDONLD P等[13-14]提出，青貯發(fā)酵劑的微生物應(yīng)具有均一發(fā)酵途徑，可利用葡萄糖等各種糖類快速發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，從而快速降低pH，使pH降到4.0以下，以抑制其他微生物的生長(zhǎng)；席琳喬等[15]從玉米青貯飼料中分離得到了2株干酪乳桿菌，可在pH 4.0～8.0條件下生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及16S rDNA基因序列分析方法從自然發(fā)酵的堆貯木薯渣中篩選出產(chǎn)酸及耐酸能力強(qiáng)的9株乳酸菌，分別為3株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、3株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、1株丘狀乳桿菌（Lactobacillus collinoides）、1株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、1株類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）。所篩選的菌株在pH 3.50～7.50均能生長(zhǎng)，6 h產(chǎn)酸能力均達(dá)pH 4.5以下，其中菌株Y12和M14的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在發(fā)酵15 h后，其pH值均在3.60以下，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸及耐酸性，完全符合WHITTENBURY R[16]制定的乳酸菌劑篩選標(biāo)準(zhǔn)的核心觀點(diǎn)，皆可用于木薯渣堆貯的發(fā)酵，為后續(xù)制備木薯渣發(fā)酵飼料的乳酸菌發(fā)酵劑奠定了基礎(chǔ)。

[1]WEINBERG Z,ASHBELL G,HEN Y,et al.The effect of applying lactic acidbacteriaatensilingontheaerobicstabilityofsilages[J].J Appl Bacteriol,1993,75(6)：512-518.

[2]SEALE D R.Bacterial inoculants as silage additives[J].J Appl Bacteriol,1986,61(15)：9-26.

[3]馬靜靜，王小芬，程序，等.乳酸菌發(fā)酵使木薯淀粉殘?jiān)暳匣芯縖J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（6）：267-272.

[4]朱軍莉，趙進(jìn)，朱雅霏.自然發(fā)酵蔬菜制品中降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離與鑒定[J].中國(guó)釀造，2015，34（6）：39-42.

[5]婁利嬌，胡萍，湛劍龍，等.分離自貴州侗族苗族發(fā)酵肉中兩株乳酸菌的耐受特性分析[J].中國(guó)釀造，2015，34（11）：126-130.

[6]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999：3-5，54-57，100-102.

[7]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：370-410.

[8]BUCHNAN R,GIBBONS E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1984：591-622.

[9]何蕾.我國(guó)傳統(tǒng)奶制品中乳酸菌多樣性研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[10]BOYD M A,ANTONIO M A D,HILLIER S L.Comparison of API 50 CH strips to whole-chromosomal DNA probes for identification ofLactobacillus species[J].J Clin Microbiol,2005,43(10)：5309-5311.

[11]汪瑞忠，吳燕芬，劉艷，等.自制GNW21E反應(yīng)板和API20E在革蘭陰性桿菌鑒定中的結(jié)果比較[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2002，17（2）：111-112.

[12]張慧杰，玉柱，王林，等.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選[J].草地學(xué)報(bào)，2011，19（1）：137-141.

[13]MEDONALD P,HENDERSON A R,HERON S J E.The biochemistry of silage[M].Marlow,UK：Chalcombe Publications,1991：399.

[14]WOOLFORD M K.The detrimental effects of air on silage[J].J Appl Bacteriol,1990,68：101-112.

[15]席琳喬，吳書奇，史卉玲，等.青貯玉米優(yōu)良乳酸菌的分離與篩選[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（3）：102-105.

[16]WHITTENBURY R.An investigation of the lactic acid bacteria[J]. Curr Opin Biotech,1962,7(4)：449-456.

Isolation,identification and acid-producing ability of lactic acid bacteria from cassava residues

YANG Chengjian,XIE Fang,LIANG Xin,LIANG Xianwei*,LI Mengwei,LI Lili,PENG Kaiping
(Guangxi Key Laboratory of Buffalo Genetics,Breeding and Reproduction,Guangxi Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China)

Nine strains were isolated from natural fermentation cassava residues by traditional culture method and identified by morphology of strain, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The results showed that nine strains wereLactobacillussp.,and strains Y5,Y13 and M14 wereLactobacillus casei,strains Y6,Y12 and M12 wereLactobacillus plantarum,strain Y7 wasLactobacillus collinoides, strain M9 wasLactobacillus paracasei,strain M11 wasLactobacillus parabuchneri.The results of acid-producing and acid-resisting experiments showed that five strains all had stronger acid-producing ability and acid resistance.After fermentation of 6 h,the pH in fermentation liquor could be less than 4.50.The acid-producing ability of strains Y12 and M14 was the strongest,and the pH of strains Y12 and M14 were both less than 3.6 after fermentation of 6 h.It could be used for development and preparation of cassava residues or other silage starter cultures.

cassava residues;lactic acid bacteria;fermentation;isolation;acid-producing

Q939.9

0254-5071（2017）02-0089-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.019

2016-09-05

廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014GXNSFAA118082）；廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目（桂漁牧科201352039）；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目（2011-G26）；廣西水牛研究所人才小高地創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（水牛人才1501）

楊承劍(1981-)，男，副研究員，博士，主要從事水牛營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究工作。

*通訊作者：梁賢威(1962-)，男，研究員，碩士，主要從事水牛營(yíng)養(yǎng)與繁殖研究工作。