硬毛粗蓋孔菌預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶水解及組分變化的影響

宋麗麗，魏濤，張靜濤，孫浩，張寧亮

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

硬毛粗蓋孔菌預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶水解及組分變化的影響

宋麗麗，魏濤，張靜濤，孫浩，張寧亮

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

以硬毛粗蓋孔菌（Funalia trogii）為研究對(duì)象，比較其在不同預(yù)處理時(shí)間的產(chǎn)酶特征、預(yù)處理前后玉米秸稈酶解產(chǎn)糖量及其組分變化。結(jié)果表明，硬毛粗蓋孔菌對(duì)木質(zhì)素的降解以漆酶和錳過(guò)氧化物酶的協(xié)同作用為主導(dǎo)，漆酶和錳過(guò)氧化物酶活最高分別為341 IU/g和33IU/g。經(jīng)生物預(yù)處理14 d后的玉米秸稈酶解產(chǎn)糖量可達(dá)到350.74 mg/g秸稈，較原料提升184%。玉米秸稈組分的變化與其酶解增效密切相關(guān)，F(xiàn).trogii預(yù)處理14 d后木質(zhì)素和半纖維素含量分別降低了33.99%和36.61%，而纖維素僅降解8.77%，木質(zhì)素和半纖維素的選擇性降解，可顯著降低玉米秸稈酶解抗性屏障，提升其酶解糖化效率。硬毛粗蓋孔菌預(yù)處理玉米秸稈可實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效轉(zhuǎn)化，縮短預(yù)處理時(shí)間，降低處理成本。

硬毛粗蓋孔菌；預(yù)處理；酶解糖化；木質(zhì)素；玉米秸稈

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，各類(lèi)木質(zhì)纖維素資源尤其是農(nóng)作物秸稈來(lái)源豐富、數(shù)量巨大、分布廣泛。目前我國(guó)秸稈資源直接投入工業(yè)化生產(chǎn)的尚不足10%。木質(zhì)纖維素資源的合理轉(zhuǎn)化與利用是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的重大問(wèn)題。天然木質(zhì)纖維素具有復(fù)雜的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中木質(zhì)素被認(rèn)為是影響木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化的限制因素[1]。木質(zhì)素一方面與纖維素、半纖維素形成高度交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻礙纖維素酶的擴(kuò)散與分布，另一方面，與纖維素酶形成不可逆吸附，引起纖維素酶蛋白失活。預(yù)處理技術(shù)可有效降低木質(zhì)素含量，破壞木質(zhì)纖維素大分子結(jié)構(gòu)、增加原料多孔性等，提升生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率[2]。各類(lèi)熱化學(xué)處理技術(shù)（如酸、堿處理，有機(jī)溶劑處理、蒸汽爆破等）[3-6]雖然可以有效提升木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化效率，但由于存在污染大、能耗高等問(wèn)題，并且在預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生后期對(duì)酶解糖化不利的物質(zhì)（如糠醛、呋喃等）[7]，因此急需尋找一種綠色環(huán)保的處理方法。

白腐菌是自然界中唯一可以將木質(zhì)素完全降解的微生物，由于其強(qiáng)大的木質(zhì)素降解酶系（漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶），在降解生物質(zhì)及異生物質(zhì)等方面具有其他生物系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)、生物制漿、染料脫色、生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)等領(lǐng)域[8-10]。利用白腐菌進(jìn)行秸稈微生物發(fā)酵是生物技術(shù)在新能源轉(zhuǎn)化應(yīng)用的熱點(diǎn)研究課題。WAN C等[11]使用蟲(chóng)擬蠟菌預(yù)處理玉米秸稈42 d后，選擇性降解39.2%木質(zhì)素，較多的保留了纖維素和半纖維素，經(jīng)預(yù)處理后的玉米秸稈產(chǎn)量為57%～67%，顯著高于對(duì)照秸稈。YU H B等[12]等采用白腐菌與堿氧化相結(jié)合的預(yù)處理方法，使玉米秸稈的酶解糖化效率較單獨(dú)堿處理提高50.7%，而且纖維素酶用量減少了24.8%，大大降低了木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成本。我國(guó)真菌資源豐富，白腐菌降解木質(zhì)纖維素基質(zhì)的研究多集中在少數(shù)模式菌株，如黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）[13]、雜色云芝（Trametes versicolor）[14]、蟲(chóng)擬蠟菌（Ceriporiopsissubvermispora）[15]、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）[16]等，開(kāi)發(fā)新型非模式菌株對(duì)白腐菌資源的開(kāi)發(fā)利用研究具有重要意義。硬毛粗蓋孔菌（Funalia trogii）屬于非褶菌目多孔菌科粗毛蓋孔菌屬，腐生于楊木、柳木，造成木材的白色腐朽[17]。由于產(chǎn)漆酶活力較強(qiáng)，在漆酶資源開(kāi)發(fā)、染料脫色、廢水處理等方面均有相關(guān)報(bào)道[18-19]。但以該菌作為預(yù)處理菌株應(yīng)用于生物質(zhì)預(yù)處理研究相對(duì)較少。

本研究以硬毛粗蓋孔菌（Funalia trogii）為出發(fā)菌株，研究其生長(zhǎng)速度、產(chǎn)酶活性及對(duì)玉米秸稈的降解影響，以預(yù)處理后玉米秸稈酶解產(chǎn)糖量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究預(yù)處理過(guò)程中組分變化與酶解產(chǎn)糖的關(guān)系，以期利用白腐菌預(yù)處理實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素資源的高效轉(zhuǎn)化與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硬毛粗蓋孔菌（Funalia trogii）：來(lái)源于鄭州輕工業(yè)學(xué)院生物能源與系統(tǒng)生物學(xué)研究室，4℃斜面保存。

玉米秸稈：來(lái)源于河南信陽(yáng)，自然風(fēng)干，粉碎后過(guò)20目篩備用。

2,2-連氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（agreement of basic telecommunications services，ABTS）和纖維素酶（cellulase，No.22178）：美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；梅特勒PL203/01型電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；安捷倫1260型高效液相色譜：美國(guó)安捷倫公司；LRH-1500F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；蘇凈SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；QYC-2012C恒溫?fù)u床：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)特性

打孔接種菌株F.trogii于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)平板中央，接種塊直徑為0.5 cm，分別置于23℃、28℃、32℃靜置培養(yǎng)，菌株生長(zhǎng)特性依照菌絲直徑法和菌絲干質(zhì)量法測(cè)定[20]。

1.3.2 白腐菌預(yù)處理玉米秸稈

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上活化的菌株轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d即為種子液。稱(chēng)取5 g烘干后的玉米秸稈于250 mL三角瓶中，加入15 mL蒸餾水，121℃滅菌30 min，按10%接種比例接入種子液，置于28℃靜置培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d、35 d，樣品烘干備用。

1.3.3 粗酶液制備

將培養(yǎng)一定時(shí)間的玉米秸稈以1∶15（g∶mL）的比例加入蒸餾水，充分混合均勻，150 r/min常溫振蕩4 h后3 000 r/min離心，上清液即為胞外粗酶液。

1.3.4 玉米秸稈酶解糖化

準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理前后玉米秸稈樣品0.16 g，按酶負(fù)荷為20 FPU/g加入纖維素酶液，50℃水浴酶解72 h，離心收集濾液。

1.3.5 測(cè)定方法

總纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力測(cè)定：按參考文獻(xiàn)[21-25]方法測(cè)定。酶活力定義為每分鐘轉(zhuǎn)化底物的微摩爾數(shù)，IU。

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量測(cè)定：參照美國(guó)可再生源實(shí)驗(yàn)室（nationalrenewableenergylaboratory，NREL）制定標(biāo)準(zhǔn)[26]。

還原糖含量測(cè)定：以二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定濾液中還原糖含量[27]。計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1F.trogii在不同溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)速度和生物量比較

F.trogii在馬鈴薯葡萄糖固體平板上接種2 d后萌發(fā)，菌絲呈現(xiàn)白色絲狀蔓延，無(wú)滲出液。不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲生物量變化見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)硬毛粗蓋孔菌菌落生長(zhǎng)速度(a)和菌絲生物量變化(b)的影響Fig.1 Effect of temperature on mycelium growth(a)and biomass changes(b)ofF.trogii

由圖1（a）可知，F(xiàn).trogii在23～32℃溫度區(qū)間范圍內(nèi)均能正常生長(zhǎng)，其中28℃條件下菌絲平均生長(zhǎng)速度為0.45cm/d，高于23℃（0.39 cm/d）和32℃（0.42 cm/d）條件下的生長(zhǎng)速度，說(shuō)明此菌在28℃條件下生長(zhǎng)較快，在培養(yǎng)第10天時(shí)菌絲布滿(mǎn)整個(gè)平板。

由圖1（b）可知，28℃培養(yǎng)8 d后菌絲生物量達(dá)到最高，為5.23 g/L，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，生物量逐漸降低，可能是由于菌絲老化自溶所致。23℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)調(diào)整期相對(duì)較長(zhǎng)，菌絲生物量低，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。32℃培養(yǎng)條件下，菌絲生長(zhǎng)調(diào)整期相對(duì)較短，但最大生物量?jī)H為3.89 g/L，且培養(yǎng)后期生物量降低顯著。

綜合比較不同培養(yǎng)溫度，硬毛粗蓋孔菌在28℃條件下生長(zhǎng)速度較快且菌絲生物量較高，因此選擇28℃作為后期預(yù)處理培養(yǎng)溫度。

2.2 F.trogii預(yù)處理玉米秸稈酶活變化

白腐菌在以木質(zhì)纖維素作為基質(zhì)生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)分泌一系列胞外酶以降解木質(zhì)纖維素各組分供自身生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需要，因此，以總纖維素酶活衡量白腐菌胞外纖維素酶活力，以木聚糖酶活衡量白腐菌胞外半纖維素酶活力，以漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶衡量白腐菌胞外木質(zhì)素酶活力，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 硬毛粗蓋孔菌預(yù)處理玉米秸稈不同時(shí)間漆酶(a)、錳過(guò)氧化物酶(b)、纖維素酶(c)、木聚糖酶(d)酶活變化Fig.2 Changes of laccase(a),manganese peroxidase(b),cellulase(c)and xylanese(d)activities during pretreatment of corn stover usingF.trogii

由圖2可知，F(xiàn).trogii胞外木質(zhì)素降解酶以漆酶和錳過(guò)氧化物酶為主導(dǎo)，并未測(cè)到木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力。漆酶和錳過(guò)氧化物酶活力均在14 d時(shí)達(dá)到最高，分別為341 IU/g和33 IU/g，F(xiàn).trogii在預(yù)處理前期即表現(xiàn)出較高的木質(zhì)素降解酶活力。研究表明，白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解通常是依賴(lài)于兩種或兩種以上木質(zhì)素降解酶，單一木質(zhì)素降解酶很難將木質(zhì)素徹底礦化[28]，漆酶主要催化木質(zhì)素碳碳鍵和碳氧鍵的斷裂，催化木質(zhì)素側(cè)鏈脫甲基，參與木質(zhì)素解聚和聚合反應(yīng)[29]，錳過(guò)氧化物酶能夠特異性的催化木質(zhì)素Cα-Cβ鍵的斷裂、Cα的氧化以及烷基-苯環(huán)間連鍵的斷裂[30]。本研究中F.trogii對(duì)木質(zhì)素的降解主要依賴(lài)于漆酶與錳過(guò)氧化物酶的協(xié)同作用。

白腐菌在降解木質(zhì)素的同時(shí)，也會(huì)對(duì)纖維素和半纖維素有一定程度的利用。纖維素酶活力在預(yù)處理14 d時(shí)達(dá)到最高，且整體呈現(xiàn)出較低的水平，推測(cè)F.trogii在預(yù)處理的過(guò)程中對(duì)纖維素的利用能力低，較多保留了纖維素作為后期發(fā)酵可利用底物。相較于與纖維素酶活，F(xiàn).trogii則呈現(xiàn)出較高的木聚糖酶活力水平，且隨預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)酶活逐漸升高。推測(cè)F.trogii在預(yù)處理過(guò)程中主要利用半纖維素作為能源和碳源來(lái)源。

2.3F.trogii預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶水解的影響

預(yù)處理的目的是破壞木質(zhì)纖維素基質(zhì)抗性屏障作用，暴露更多纖維素區(qū)域，釋放更多可利用糖類(lèi)[7]。硬毛粗蓋孔菌F.trogii預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶解產(chǎn)糖的影響見(jiàn)圖3。

圖3 硬毛粗蓋孔菌預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶解產(chǎn)糖的影響Fig.3 Effect ofFunalia trogiipretreatment on sugar production from corn stover by hydrolysis

由圖3可知，未經(jīng)生物改性的原料玉米秸稈由于結(jié)構(gòu)致密，酶解抗性較大，酶解后還原糖產(chǎn)量?jī)H為123.44 mg/g秸稈，生物處理后的玉米秸稈相較于對(duì)照還原糖產(chǎn)量均有顯著提升。當(dāng)白腐菌預(yù)處理14 d后，玉米秸稈酶解還原糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為350.74 mg/g秸稈，較未處理秸稈提高184%，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)糖量逐漸下降，推測(cè)可能是由于F.trogii對(duì)纖維素和半纖維素過(guò)度消耗所造成的。由于白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解是次級(jí)代謝的過(guò)程，預(yù)處理時(shí)間周期相對(duì)較長(zhǎng)（幾周甚至幾個(gè)月），如XU C Y等[31]的研究結(jié)果表明，乳白耙菌（Irpex lacteus）預(yù)處理25 d后玉米秸稈酶解糖化效率較對(duì)照提升152.5%。本研究中使用的硬毛粗蓋孔菌（F.trogii）14 d就能實(shí)現(xiàn)高效纖維質(zhì)乙醇發(fā)酵，大大縮短了生物預(yù)處理時(shí)間，具有較大的應(yīng)用和研究意義。

2.4 F.trogii預(yù)處理玉米秸稈組分變化

白腐菌生物預(yù)處理玉米秸稈酶解增效作用來(lái)源于對(duì)木質(zhì)纖維素基質(zhì)的生物改性，玉米秸稈主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大成分構(gòu)成，三組分含量變化是導(dǎo)致酶解增效的關(guān)鍵影響因素。對(duì)硬毛粗蓋孔菌（F.trogii）預(yù)處理前后玉米秸稈組成成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 硬毛粗蓋孔菌預(yù)處理玉米秸稈不同時(shí)間組分變化Fig.4 Components change of biopretreated corn stover during pretreatment of corn stover usingFunalia trogii

由圖4可知，經(jīng)硬毛粗蓋孔菌F.trogii預(yù)處理后的玉米秸稈隨時(shí)間的延長(zhǎng)質(zhì)量損失不斷增加，預(yù)處理35 d的質(zhì)量損失為46.02%，過(guò)高的質(zhì)量損失不利于后期酶水解及乙醇發(fā)酵，秸稈利用率較低，因此，短期生物處理是實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)高效利用的關(guān)鍵途徑。生物預(yù)處理7 d的玉米秸稈和原料秸稈木質(zhì)素含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05)，主要表現(xiàn)在半纖維素的損失，降解率為24.15%，說(shuō)明生物預(yù)處理前期以菌體生長(zhǎng)為主，木質(zhì)素酶分泌及木質(zhì)素降解均為次級(jí)代謝過(guò)程，時(shí)間相對(duì)滯后。生物處理14 d酶解糖化效率最高，此時(shí)的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分別降解了8.77%、36.61%和33.99%。硬毛粗蓋孔菌（F.trogii）在生物改性玉米秸稈的過(guò)程中，選擇性降解木質(zhì)素，降低玉米秸稈酶解反應(yīng)抗性屏障，在降解可利用底物方面，以半纖維素作為主要碳源來(lái)源。由于半纖維素和木質(zhì)素的選擇性降解，使得纖維素在一定程度內(nèi)得到富集，提升纖維素釋放效率。增加預(yù)處理時(shí)間，雖然木質(zhì)素的含量進(jìn)一步降低，但纖維素與半纖維素的量也隨之降低。雖然生物預(yù)處理后木質(zhì)素含量的變化與酶解增效密切相關(guān)，但木質(zhì)纖維素微觀孔徑結(jié)構(gòu)、木質(zhì)素大分子內(nèi)部化學(xué)連鍵、纖維素結(jié)晶度變化均能影響后期酶解糖化效率。因此，需進(jìn)一步針對(duì)微觀結(jié)構(gòu)展開(kāi)深入研究。

3 結(jié)論

硬毛粗蓋孔菌（F.trogii）在28℃溫度條件下菌絲生長(zhǎng)速度和生物量都達(dá)到最大，在以玉米秸稈為基質(zhì)生長(zhǎng)過(guò)程中，木質(zhì)素降解酶系以漆酶和錳過(guò)氧化物酶為主導(dǎo)，纖維素酶活力較弱，半纖維素酶活力較強(qiáng)。預(yù)處理14 d酶解產(chǎn)糖量為達(dá)到350.74 mg/g秸稈，較原料提升184%。通過(guò)對(duì)預(yù)處理秸稈組分分析得知，硬毛粗蓋孔菌以選擇性降解木質(zhì)素和半纖維素為主，破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)抗性，提升木質(zhì)纖維素酶解糖化效率。本研究中硬毛粗蓋孔菌（F.trogii）處理周期較短，酶解增效作用顯著，具有一定的研究?jī)r(jià)值和實(shí)用意義，為白腐菌高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素提供研究依據(jù)。

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Effect of biological pretreatment withFunalia trogiion enzymatic hydrolysis and chemical components of corn stover

SONG Lili,WEI Tao,ZHANG Jingtao,SUN Hao,ZHANG Ningliang
(College of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China)

The enzyme-producing properties,sugar production of corn stover hydrolysis and the changes of corn stover components were investigated by biological pretreatment usingFunalia trogiibefore and after the pretreatment.Results showed thatF.trogiion lignin degradation was mainly by the synergistic effect of laccase and manganese peroxidase.The maximum enzymatic activities of laccase and manganese peroxidase were 341 IU/g and 33 IU/g,respectively.After biological pretreatment for 14 d,the maximum reducing sugar yield was 350.74 mg/g corn stover,which increased by 184% comparedtorawmaterial.Thecomponentsofcornstoverwerecloselyrelatedtotheefficiencyofhydrolysis.Ligninandhemicelluloseweredegradedby 33.99%and36.61%,respectively.Thus,cellulosewasdegradedby8.77%after 14 d biologicalpretreatment,which showed thatF.trogiicould selectively degrade lignin and semi-cellulose,thus decreased the resistance barrier of corn stover hdrolysis,and improved the yield of reducing sugar.Biological pretreatmentusingF.trogiicouldgreatlyincreasetheefficientconversionoflignocellulose,shortenpretreatmenttimeanddecreasedtreatmentcost.

Funalia trogii;pretreatment;enzymatic saccharification;lignin;corn stover

Q939.9

0254-5071（2017）02-0106-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.023

2016-10-31

河南省科技攻關(guān)(152102110104)；鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士基金(2013BSJJ005)

宋麗麗（1987-），女，講師，博士，研究方向?yàn)樯镛D(zhuǎn)化與生物。