響應(yīng)面分析法優(yōu)化玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的研究

陳炳，冷云偉*，權(quán)武，莊奎成，萬吉志，劉偉祥

(1.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221116；2.徐州恒順萬通食品釀造公司，江蘇徐州221000；3.天津?yàn)I海茶淀葡萄科技發(fā)展有限公司，天津300480）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的研究

陳炳1，冷云偉1*，權(quán)武2，莊奎成3，萬吉志1，劉偉祥3

(1.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221116；2.徐州恒順萬通食品釀造公司，江蘇徐州221000；3.天津?yàn)I海茶淀葡萄科技發(fā)展有限公司，天津300480）

以玫瑰香葡萄為原料，采用分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝釀制玫瑰香葡萄醋。通過單因素試驗(yàn)探究補(bǔ)料酒精度、補(bǔ)料時間、補(bǔ)料體積對玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，玫瑰香葡萄醋的最佳發(fā)酵工藝條件為補(bǔ)料酒精度7%vol，補(bǔ)料時間12 h，補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)33%，在此條件下，平均產(chǎn)酸速率為0.32 g/(100 mL·h)。

玫瑰香葡萄醋；響應(yīng)面分析；分割補(bǔ)料發(fā)酵；優(yōu)化

食醋的由來源遠(yuǎn)流長，歷史久遠(yuǎn)，相傳是由杜康之子黑塔發(fā)明的，其出現(xiàn)和酒有千絲萬縷的聯(lián)系，是千百年來勞動人民智慧的結(jié)晶[1-3]。在今天，食醋不僅僅是一種簡單的調(diào)味品，更是一種保健食品。因?yàn)槭炒赘缓被帷⒕S生素和礦物質(zhì)等，具有緩解疲勞、促進(jìn)食欲、增強(qiáng)人體免疫力等功能[4]。果醋顧名思義就是水果經(jīng)過微生物發(fā)酵而來的酸味調(diào)味品[5-7]，其不僅僅有食醋的酸味，還帶有水果的果香味和甜味，尤以蘋果醋和葡萄醋居多，深受廣大人民群眾喜愛。

從20世紀(jì)80年代開始，在傳統(tǒng)食醋的基礎(chǔ)上，結(jié)合國外生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，國內(nèi)開始了對果醋的研究[8]。目前主要果醋的果品資源有：蘋果、葡萄、水蜜桃、菠蘿、香蕉等等。但是絕大多數(shù)果醋加工技術(shù)處于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)階段，規(guī)模比較小，尤以葡萄醋和蘋果醋居多。按照葡萄醋的發(fā)酵狀態(tài)可以分為三種發(fā)酵工藝：全固態(tài)發(fā)酵法、全液態(tài)發(fā)酵法、前液后固發(fā)酵法。截至目前，國內(nèi)葡萄醋生產(chǎn)規(guī)模不大，產(chǎn)品宣傳力度不夠，生產(chǎn)工藝不完善，產(chǎn)品質(zhì)量一般，這些種種原因制約著葡萄醋的發(fā)展。

本研究采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)對玫瑰香葡萄醋進(jìn)行分割補(bǔ)料發(fā)酵[9]，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對玫瑰香葡萄醋的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到玫瑰香葡萄醋的最佳發(fā)酵工藝和質(zhì)量合格的玫瑰香葡萄醋產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄：天津市茶淀葡萄科技園；安琪紅葡萄酒發(fā)酵酵母：湖北安琪酵母有限公司；滬釀1.01醋酸菌：上海釀造一廠。

偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、酚酞（均為分析純）：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。酵母菌培養(yǎng)基[10]：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。醋酸菌試管斜面培養(yǎng)基[11]：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%碳酸鈣，2%瓊脂粉。

醋酸菌液體種子培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%碳酸鈣。

1.2 儀器與設(shè)備

XFS-280E立式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；GNP-9050BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG-A回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備公司；100 L自吸式發(fā)酵罐：徐州恒順萬通食品釀造公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰香葡萄醋的分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝

（1）玫瑰香葡萄破碎除梗：選取顆粒飽滿質(zhì)量上乘的玫瑰香葡萄，破碎除梗后備用。

（2）酵母菌的活化：將酵母菌于酵母菌培養(yǎng)基28℃活化培養(yǎng)48 h。

（3）酒精發(fā)酵：將0.000 2%酵母菌接種于處理后的葡萄中，添加0.0001%偏重亞硫酸鉀，然后在30℃條件下經(jīng)過酒精發(fā)酵制成玫瑰香葡萄酒，其中主酵期6d，后酵期15d。

（4）調(diào)整初始酒精度：按一定比例加入無菌水得到不同酒精度的玫瑰香葡萄酒。

（5）醋酸菌的培養(yǎng)：①種子活化：將醋酸菌于無菌條件下接種到醋酸菌試管斜面培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)48 h，備用。②液體種子培養(yǎng)：將試管斜面上生長良好的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，于30℃，100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

（6）醋酸發(fā)酵：將玫瑰香葡萄酒的初始酒精度調(diào)整為7%vol，然后投料到發(fā)酵罐中，接入10%醋酸菌，保持溫度30℃，通風(fēng)量為1.2 L/min[12]。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到一定階段后，每隔一定時間放出一定體積的發(fā)酵液，然后補(bǔ)入等體積的玫瑰香葡萄酒，如此反復(fù)發(fā)酵。

1.3.2 玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)

選取補(bǔ)料酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、補(bǔ)料時間（8 h、10 h、12 h、14 h、16 h）和補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)（24%、27%、30%、33%、36%）3個因素，測定發(fā)酵過程中發(fā)酵液平均產(chǎn)酸速率的變化。

1.3.3 玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對玫瑰香葡萄醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的方法，以補(bǔ)料酒精度（A）、補(bǔ)料時間（B）、補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)（C）為影響因子，玫瑰香葡萄醋發(fā)酵液的平均產(chǎn)酸速率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.3.4 測定方法

酸度測定：采用酸堿滴定法[13]；酒精度測定：采用蒸餾法[14]；感官指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測定：根據(jù)國標(biāo)GB 18187—2000《釀造食醋》和GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中的方法進(jìn)行評定[15-16]；平均產(chǎn)酸速率的測定：取一定玫瑰香葡萄醋發(fā)酵時間內(nèi)發(fā)酵液酸度的變化值與時間的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)料酒精度對玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

圖1 補(bǔ)料酒精度對發(fā)酵液平均產(chǎn)酸速率的影響Fig.1 Effect of feeding alcohol content on the average acid production rate of fermented liquid

由圖1可知，隨著補(bǔ)料酒精度的增加，發(fā)酵液的平均產(chǎn)酸速率升高。但是當(dāng)補(bǔ)料酒精度＞7%vol時，發(fā)酵液的平均產(chǎn)酸速率降低。這是由于隨著補(bǔ)料酒精度的增加，醋酸菌的營養(yǎng)物質(zhì)也增加，醋酸菌生長繁殖迅速，因而醋酸菌產(chǎn)酸速率加快；但是當(dāng)補(bǔ)料酒精度過高時，反而抑制醋酸菌的生長繁殖，產(chǎn)酸能力受到抑制，因而醋酸醋酸菌產(chǎn)酸速率降低。當(dāng)補(bǔ)料酒精度為7%vol時，醋酸菌平均產(chǎn)酸速率最高，達(dá)到0.300g/（100mL·h）。因此，選取6%vol、7%vol、8%vol作為響應(yīng)面取值范圍。

2.2 補(bǔ)料時間玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

圖2 補(bǔ)料時間對發(fā)酵液平均產(chǎn)酸速率的影響Fig.2 Effect of feeding time on the average acid production rate of fermented liquid

由圖2可知，隨著補(bǔ)料時間的延長，發(fā)酵液的平均產(chǎn)酸速率先升高后降低。當(dāng)補(bǔ)料時間為12 h時，醋酸菌平均產(chǎn)酸速率最高，達(dá)到0.313 g/（100 mL·h）。這是因?yàn)檠a(bǔ)料時間過短，發(fā)酵液中的酒精利用不充分，因而醋酸菌沒有得到充分的生長繁殖，產(chǎn)酸能力弱；補(bǔ)料時間過長，發(fā)酵液中的酒精被消耗殆盡，有害代謝物開始積累，醋酸菌出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，選取10 h、12 h、14 h為響應(yīng)面的取值范圍。2.3補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)對玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

圖3 補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)對發(fā)酵液平均產(chǎn)酸速率的影響Fig.3 Effect of feeding volume fraction on the average acid production rate of fermented liquid

由圖3可知，隨著補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)酵液的平均產(chǎn)酸速率也增加。當(dāng)補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)為33%時，其平均產(chǎn)酸速率最快，為0.317 g/（100 mL·h）。當(dāng)補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)再增加時，發(fā)酵液的平均產(chǎn)酸速率反而下降。這是由于隨著補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)的增加，醋酸菌可以利用的營養(yǎng)物質(zhì)更加豐富，因而醋酸菌的產(chǎn)酸能力加強(qiáng)；但是補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)過高，放料放出的醋酸菌也變多，前后物料的差異也變大，因而醋酸菌的生長繁殖受到抑制。從實(shí)際生產(chǎn)考慮，當(dāng)補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)增加時，也變相提高了設(shè)備利用率，提高生產(chǎn)速度。因此，選取30%、33%、36%為響應(yīng)面的取值范圍。

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面模型的建立及顯著性分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

利用Design Expert 8.05b軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert 8.05b軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析后建立玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的參數(shù)回歸模型，回歸方程為：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為了對玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的參數(shù)回歸模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，模型極顯著（P＜0.001），失擬值不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程的擬合效果好，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案具有可操作性。二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著，說明對響應(yīng)值有極顯著影響。A、B、C三個因素對響應(yīng)值的影響效果大小為：C＞B＞A。R2=0.998 4＞0.9，說明此模型具有可靠性，R2adj=0.996 3，說明此模型可以解釋大約99.63%響應(yīng)值的變化，因此回歸方程的擬合程度較好。該回歸方程變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為0.98%，在可以接受的范圍之內(nèi)。所以試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值之間具有良好的擬合度，可以用此參數(shù)回歸模型來對玫瑰香葡萄醋的發(fā)酵過程進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.4.2 響應(yīng)面及等高線分析

由圖4可知，隨著補(bǔ)料時間的延長，補(bǔ)料酒精度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；隨著補(bǔ)料酒精度的增加，補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；隨著補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)的增大，補(bǔ)料時間呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。為了進(jìn)一步確定最佳響應(yīng)值的因素水平組合，采用Design Expert 8.05b軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，得到3個單因素的最佳組合：補(bǔ)料酒精度為7.01%，補(bǔ)料時間為11.98 h，補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)為32.93%，此時，最佳響應(yīng)值平均產(chǎn)酸速率為0.322 g/（100 mL·h）。

圖4 補(bǔ)料酒精度、補(bǔ)料時間和補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)的交互作用對平均產(chǎn)酸速率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between feeding alcohol content,feeding time and volume fraction on the average acid production rate

鑒于在實(shí)際生產(chǎn)中操作的可行性，最終把玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的參數(shù)修正為：補(bǔ)料酒精度為7%vol，補(bǔ)料時間為12 h，補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)為33%，在此條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，最后得到的平均產(chǎn)酸速率為0.324 g/（100 mL·h），與理論預(yù)測值相差較小，因此，應(yīng)用響應(yīng)面分析法建立的玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝模型的參數(shù)是可行的。

2.5 玫瑰香葡萄醋的感官指標(biāo)和微生物指標(biāo)

參照國標(biāo)GB 18187—2000《釀造食醋》和國標(biāo)GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的要求，對在最優(yōu)工藝條件下釀造所得的玫瑰香葡萄醋進(jìn)行感官評價(jià)和微生物指標(biāo)測定，結(jié)果表明，玫瑰香葡萄醋澄清無雜質(zhì)，粉紅色，酸味柔和無異味，具有玫瑰香葡萄的果香味和醋香味，菌落總數(shù)、大腸桿菌和致病菌未檢測出。所釀造的玫瑰香葡萄醋感官和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究以玫瑰香葡萄為原料釀造葡萄醋，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化玫瑰香葡萄醋的發(fā)酵工藝，得出最佳工藝參數(shù)為：補(bǔ)料酒精度7%vol，補(bǔ)料時間為12 h，補(bǔ)料體積分?jǐn)?shù)為33%，此時平均產(chǎn)酸速率為0.324g/（100mL·h），其感官指標(biāo)和微生物指標(biāo)都符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

通過對玫瑰香葡萄醋發(fā)酵工藝的研究，探索不同發(fā)酵條件對發(fā)酵進(jìn)程的影響，為以后葡萄醋的研究奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時變相延長了葡萄的儲存方式和時間，深化了葡萄的利用價(jià)值，延長了葡萄的加工產(chǎn)業(yè)鏈。

[1]趙芳，李志民，陳斌.我國食醋生產(chǎn)的研究進(jìn)展[J].邯鄲職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，22（4）：94-96.

[2]王琳，胡平，楊立萍.淺談高濃度醋的應(yīng)用及市場前景[J].江蘇調(diào)味副食品，2004，21（5）：5-8.

[3]張麗娟.恒順香醋醋酸發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化分析[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[4]席青，張德純.醋的保健功能及其制品的研究現(xiàn)狀[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（10）：954-957.

[5]王毅，劉學(xué)文，伍學(xué)明.檸檬果醋醋酸發(fā)酵工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：75-78.

[6]張鋒，金杰，劉春芬，等.果醋抗氧化作用研究進(jìn)展[J].中國釀造，2008，27（8）：8-11.

[7]靳桂敏，賀銀鳳，鐘震雄.柚子果醋及其飲料生產(chǎn)工藝研究[J].中國釀造，2007，26（2）：64-66.

[8]鮑金勇，王娟，林碧霞，等.我國果醋的研究現(xiàn)狀、存在的問題及解決措施[J].中國釀造，2006，25（10）：1-4.

[9]冷云偉，徐根娣，趙梅，等.分批補(bǔ)料乙酸發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].徐州工程學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，24（4）：19-23.

[10]劉紹軍，劉暢，張艷霞，等.特色玫瑰香葡萄酒發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，26（1）：1-4

[11]孫文瑛，陳雄，石勇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基[J].化學(xué)與生物工程，2011，28（1）：37-41.

[12]王璐，閆曉菲，李艷云，等.響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄醋發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造，2014，33（7）：55-58.

[13]中國食品發(fā)酵工業(yè)研究.GB/T 12456—2008食品中總酸的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.49—2008發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[15]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB 18187—2000釀造食醋[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.

[16]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2719—2003食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

Optimization of fermentation process of muscat grape vinegar by response surface methodology

CHEN Bing1,LENG Yunwei1*,QUAN Wu2,ZHUANG Kuicheng3,WAN Jizhi1,LIU Weixiang3
(1.School of Chemical Engineering&Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China; 2.Xuzhou Hengshun Wantong Food Brewing Company,Xuzhou 221000,China;3.Tianjin Binhai Chadian Grape Technology Development Co.,Ltd.,Tianjin 300480,China)

Using muscat grape as raw material,muscat grape vinegar was produced by segmentation feeding fermentation.The effects of feeding alcohol content,feeding time and volume on fermentation process of the muscat grape vinegar were researched by single factor experiment.Response surface methodology was used to optimize the fermentation process based on single factor experiment.The results showed that the optimum conditions were as follows：feeding alcohol content 7%vol,feeding time 12 h and volume fraction 33%.Under the conditions,the average acid production rate was 0.32 g/(100 ml·h).

muscat grape vinegar;response surface analysis;segmentation feeding fermentation;optimization

TS264.22

0254-5071（2017）02-0111-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.024

2016-11-24

蘇北科技專項(xiàng)（BN2016038）

陳炳（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：冷云偉（1965-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。