水牛乳中可培養乳酸菌多樣性分析

謝芳，楊承劍*，楊小梅，唐艷，曾慶坤

(中國農業科學院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

水牛乳中可培養乳酸菌多樣性分析

謝芳，楊承劍*，楊小梅，唐艷，曾慶坤

(中國農業科學院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

采用傳統分離培養方法，從三品雜交生水牛奶混合樣品中，分離出105株乳酸菌，通過形態、生理生化、API細菌鑒定系統及16S rDNA基因序列分析方法對各菌株屬種進行鑒定。16S rRNA序列分析結果顯示，105株菌共分為5個屬8個種，呈現較為豐富的乳酸菌多樣性，具體數量分布為乳酸乳球菌21株，植物乳桿菌19株，格氏乳球菌17株，乳明串珠菌13株，食竇魏斯氏菌11株，腸膜明串珠菌8株，類腸膜魏斯氏菌6株，嗜熱鏈球菌5株，糊精乳桿菌5株。由此可知，水牛乳中可培養乳酸菌優勢菌群的主次關系為：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）＞植物乳桿菌（Lactobacillus plantaru）＞格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）＞乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）＞食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），此為后續開發水牛乳中優勢乳酸菌資源提供了良好的理論基礎。

水牛乳；可培養菌株；乳酸菌；多樣性；16S rDNA

我國水牛資源豐富，主要分布在廣東、廣西、云南等南方十八省區，它具有較強的免疫力，迄今尚未有水牛瘋牛病例報道[1]。據報道，水牛奶蛋白質、脂肪、維生素、微量元素含量均高于黑白花牛奶，且口味香醇，營養全面，在民間享有“奶中之王”的美譽[2-3]，隨著人們生活水平的提高，水牛奶制品也日漸成為人們消費的“新寵”。

水牛乳在其自然發酵過程中，牛乳發酵產酸，酪蛋白遇酸凝固，即成酸奶[4]，而賦予酸奶獨特風味和良好凝乳狀態的關鍵微生物，便是乳酸菌，其益生性、抑菌性及發酵性一直成為國內外學者研究的熱點。近年來，有文獻對不同地區發酵乳制品中乳酸菌多樣性進行了一些分析[5]，但有關水牛乳及其發酵乳中乳酸菌多樣性的研究少見報道。API（analytic products INC）鑒定系統是由法國生物-梅里埃公司生產的細菌數值分類鑒定系統，該生化鑒定是根據微生物對各種生理條件、生化指標、代謝反應進行分析，并將結果轉化成軟件可以識別的數據，進行聚類分析，與已知的參比菌數據庫進行比較，最終對未知菌進行鑒定的一種技術。它目前有1 000種生化反應，可鑒定的細菌大于550種，是世界范圍內應用最廣、最受微生物科學家推崇的國際標準化產品，相較傳統的生化發酵試驗，快速省力[6]，但僅限于可培養菌的鑒定，對于非可培養菌的鑒定有一定限制，必須結合分子生物學技術來共同完成。本研究旨在通過傳統培養、API鑒定系統和16S rDNA序列分析，全面深入了解水牛乳中乳酸菌的組成及優勢菌群，擬從水牛乳中分離出一些可培養的乳酸菌，將其運用到水牛發酵乳的生產開發中，所謂“源于水牛乳而用于水牛乳”，使這些安全而優質的乳酸菌資源得以保留，并為后續開發具有自主知識產權的優良乳酸菌種和益生型水牛酸乳提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

生鮮水牛乳樣品3份，于實驗當天取自廣西水牛研究所水牛種畜場，為三品雜交[7]水牛奶，水牛品種為：巴基斯坦尼里-拉菲、印度摩拉、廣西本地水牛，在取樣30 min內到達實驗室，將3份樣品混勻過濾后進行分菌實驗。

1.1.2 培養基

乳酸菌分離培養基（MRS）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉8 g，酵母浸粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，瓊脂14 g，吐溫-80 1 g，蒸餾水1 000 mL。

M17瓊脂培養基：大豆胨5 g，蛋白胨2.5 g，酪蛋白胨2.5 g，酵母浸粉2.5 g，牛肉浸粉5.0 g，乳糖5.0 g，抗壞血酸鈉0.5 g，β-甘油磷酸鈉19.0 g，硫酸鎂0.25 g，瓊脂12.75 g，蒸餾水1000mL，固體培養基為含20g/LCaCO3的M17培養基。

MRS肉湯培養基：酪蛋白酶消化物10 g，肉膏粉10 g，酵母膏粉4 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，磷酸氫二鉀2.0 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1.08 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

API 50 CH/API 20 E試劑條、API50 CHL培養基：法國梅里埃公司；30%過氧化氫：天津市科密歐化學試劑有限公司；G1060革蘭氏染色試劑盒：北京索寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SPX-150生化培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器材有限公司；HC-2518R冷凍高速離心機：BBI北京京立離心機有限公司；JD500-2型電子天平：梅特勒-托多利儀器有限公司；尼康ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡：Nikon日本公司；DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩壓電泳儀：北京六一儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽：上海一恒科學儀器有限公司；FR980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司；2720 thermal cycler PCR儀：Applied Biosystems美國應用生物系統公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的培養、分離與純化

將生鮮水牛乳進行梯度稀釋后分別涂布于改良MRS平板和含20 g/L CaCO3的M17平板上，于37℃培養24 h。挑取肉眼可見、生長較快、單個有溶鈣圈的菌落進行劃線、反復分離、純化，取純菌株進行革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶試驗，根據參考文獻[8-9]，選取革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性、無芽孢的菌株分別于滅菌的MRS肉湯培養基中增殖培養，將此批待選菌編號，分別取樣于4℃保存和甘油管冷凍保藏備用。

1.3.2 菌種的鑒定

采用傳統形態、生理生化[8-10]及16S rDNA基因序列測定[11]相結合的方式來鑒定菌株屬種。

API鑒定：采用API 50CH/API20 E鑒定系統分別對乳酸菌中的桿菌和球菌進行生化鑒定，API 50CH鑒定系統專用于乳酸桿菌和相關菌的鑒定，API20 E則可以作為API50CH的補充或球菌的鑒定[12]，具體操作按說明書進行。

DNA提取：使用生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，具體操作步驟詳見說明書。

聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增：使用TAKARAMightyAmp□DNAPolymeraseVer.2（R071Q）進行PCR擴增，反應體系如下：10×PCR緩沖液5 μL；正、反向引物均為10 mmol/L各2.5 μL；dNTP（10 mmol/L）4 μL；基因組DNA1.0μL；TaqDNA聚合酶0.5μL；雙蒸水34.5μL。PCR擴增循環參數為：98℃預變性2min；98℃變性10s，56℃退火15 s，72℃延伸2 min，共35個循環；再72℃延伸5 min。電泳：使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳30 min，每孔上樣2 μL。

1.3.3 菌種的保藏

將已篩選純化的菌種接種到5 mL滅菌MRS肉湯培養基中，36℃搖床培養12～24 h，取800 μL的菌株培養液與400 μL 50%滅菌甘油于2 mL離心管中混勻，-80℃冷凍保藏。后續鑒定的純菌株亦采用此法冷凍保藏。

2 結果與分析

2.1 菌株分離培養結果

根據參考文獻[8-10]，革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性、無芽胞菌，可初步定為乳酸菌。本試驗從3種混合水牛乳樣品中共分離出105株乳酸菌，主要分球菌和桿菌兩種，在顯微鏡下呈球狀和桿狀，具體細胞形態見圖1（油鏡× 100）。由圖1可知，球菌多為圓形，單個、成對或短鏈狀排列，無鞭毛，不運動；桿菌為長桿、短桿狀或成絲狀，單個、短鏈或長鏈排列，不運動。

圖1 部分乳酸菌細胞形態Fig.1 Cell morphology of part lactic acid bacteria

2.2 菌株的生理生化特性分析

將分離培養得到的105株乳酸菌，經革蘭氏染色鏡檢后，按桿菌和球菌分類標記，以API50 CH/API20 E鑒定系統進行生化鑒定。具體操作按說明書進行[13]，將培養24 h和48 h后的生化反應試劑條分別取出讀數，參照鑒定表，將結果輸入生化項分析鑒定系統查詢，即可得到菌株的種屬信息，對于符合率＞80%的，可認定為菌株的具體種屬[14]，其API生化鑒定結果見表1。

表1 菌株的API生化鑒定結果Table 1 API biochemical identification results of strains

由表1可知，在分離的105株菌中，有95株菌的API鑒定符合率都在80%以上，占總菌株數的90%，還有10株菌缺碼，占總菌株數的10%，對于這10株無法由API50 CH/API20 E鑒定得到種屬信息的菌株，可以通過后續基因測序來對其進行補充和完成。

2.3 菌株16S rDNA鑒定結果

將上述實驗中分離得到可培養的105株乳酸菌，利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，提取其乳酸菌基因組，對基因組進行16S rDNA區PCR擴增[11]，對擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇擴增效果好的部分菌株電泳結果見圖2。

圖2 部分菌株16S rDNA基因的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of part strains 16S rDNA gene

將乳酸菌基因PCR擴增成功的電泳目的條帶片段回收，送生工生物（上海）有限公司進行測序，將測序結果輸入GenBank數據庫，運用BLAST程序將測序結果與NCBI核酸數據庫中的公開序列進行比對（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast），用mega4.0構建菌株系統發育樹，結果見圖3。

圖3 部分菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of part lactic acid bacteria

由圖3可知，16SrDNA鑒定出乳酸乳球菌（Lactococcus lactissubsp.lactis）21株，植物乳桿菌（Lactobacillus plantaru）19株，格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）17株，乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）13株，食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）11株，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）8株，類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）6株，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）5株，糊精乳桿菌（Lactobacillus dextrinicus）5株。

本試驗對最初采用API生化鑒定中出現的疑似錯誤進行分析，因API系統中試劑條對溫度、氧、碳源、酶都有一定要求，而可培養菌株的適宜溫度、碳源等條件不一定一致，有局限性，鑒定結果平均符合率僅為91%，為保證菌株鑒定的準確性，故試驗補充了16S rDNA鑒定，從兩種鑒定結果來看，16S rDNA鑒定顯然更準確，API是用生化反應間接鑒定出菌種的類別，而16S rDNA鑒定是由分子水平直接準確鑒定出菌株的屬種。即一個屬于分類鑒定，另一個屬于精準鑒定，故在今后的試驗中應依據實驗所需而慎重選擇用哪種鑒定方法更合理。

3 結論

本試驗通過平板稀釋法從三品雜交生水牛奶混合樣品中分離篩選出乳酸菌105株，利用革蘭氏染色鏡檢、API細菌鑒定系統、16S rDNA基因序列分析三種方法相結合，最終鑒定出水牛乳中共有乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis）21株、植物乳桿菌（Lactobacillus plantaru）19株、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）17株、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）13株、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）11株、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）8株、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）6株、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）5株、糊精乳桿菌（Lactobacillus dextrinicus）5株，分別涉及到乳酸菌的乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈球菌屬（Streptococeus）、魏斯氏菌屬（Weissella）共5個屬8個種，呈現出較為豐富的多樣性，具體菌株數量占分離總菌株數的百分比分別為乳球菌36%，乳桿菌23%，明串乳菌20%，魏斯氏菌16%，鏈球菌5%。由此可見，乳球菌為水牛乳中可培養乳酸菌的優勢菌群，乳桿菌、明串珠菌的數量差別不大，可認為是水牛乳中的次要優勢菌群，再其次是魏斯氏菌和鏈球菌。這些乳酸菌大部分具有良好的益生性和發酵性，是水牛乳中寶貴的菌種資源。目前我國大部分的商品酸奶乳酸菌多樣性非常有限，主要是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌兩種，若將上述水牛乳中分離培養的這些安全而優良的乳酸菌資源應用于酸奶的發酵中，勢必為商品酸奶在菌種多樣性方面提供更多更優質的選擇[15]，更為后續我國南方地區特有的水牛乳功能性發酵產品的深度開發提供更多更可靠的乳酸菌菌種資源。

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Diversity analysis of culturable lactic acid bacteria in water buffalo milk

XIE Fang,YANG Chengjian*,YANG Xiaomei,TANG Yan,ZEN Qingkun
(Guangxi Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China)

105 strains were isolated from the milk samples of hybrid buffalo by traditional method in this study.The strains were identified by morphological,physiological and biochemical identification,API system and 16S rDNA gene sequence analysis.Results showed that 105 strains were classified into 5 genera and 8 species,21 strains wereLactococcus lactis,19 strains wereLactobacillus plantaru,17 strains wereLactococcus garvieae,13 strains wereLeuconostoc lactis,11 strains wereWeissella cibaria,8 strains wereLeuconostoc mesenteroides,6 strains wereWeissellaparamesenteroides,5 strains wereStreptococcus thermophilus,and 5 strains wereLactobacillus dextrinicus,which presenting a rich diversity of lactic acid bacteria.Therefore,the culturable dominate lactic bacteria in the buffalo milk in order were as follows：Lactococcus lactis,Lactobacillusplantaru,Lactococcus garvieae,Leuconostoc lactisandWeissella cibaria.The results were beneficial to the development and research of lactic acid bacteria in water buffalo milk.

buffalo milk;culturable strain;lactic acid bacteria;diversity;16S rDNA

Q939

0254-5071（2017）02-0119-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.026

2016-08-17

廣西水牛研究所基本科研業務費項目(水牛基160209)

謝芳（1980-），女，研究實習員，本科，研究方向為乳品加工。

*通訊作者：楊承劍（1981-），男，副研究員，博士，研究方向為動物營養及乳品科學。