黑曲霉產赭曲霉毒素A合成培養基的設計及產毒優化

朱柳楊，陳浩宇，李敏，朱曉娟，高慧梅，張穎，張健,*

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津300462；3.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

黑曲霉產赭曲霉毒素A合成培養基的設計及產毒優化

朱柳楊1，陳浩宇1，李敏1，朱曉娟1，高慧梅2，張穎3，張健1,2*

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津300462；3.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

針對目前沒有適合黑曲霉產赭曲霉毒素A（OTA）全合成培養基的現狀，進行黑曲霉產OTA合成培養基的設計，并優化高產OTA培養條件，以期為黑曲霉產OTA代謝和產毒機制的研究提供基礎。通過碳源、氮源的篩選確定黑曲霉產OTA合成培養基的成分，利用高效液相色譜-熒光檢測法檢測此培養基在不同時間、pH、溫度條件下OTA的產量，確定產OTA最佳培養條件。結果表明，培養基成分為FeSO4·7H2O0.01 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，Na2HPO4·2H2O0.5 g/L，KCl1.0 g/L，葡萄糖100 g/L，苯丙氨酸0.3 g/L。培養條件為初始pH值為7，培養溫度25℃，培養時間8 d。在此條件下黑曲霉產OTA產量最高，為4.19 μg/g，菌體生物量為3.4 g。

赭曲霉毒素A；黑曲霉；合成培養基；培養條件

赭曲霉毒素（ochratoxin）是某些曲霉屬和青霉屬真菌產生的一類次級代謝產物。該類物質以異香豆素交聯L-苯丙氨酸為基本結構，在此基礎上可衍生出20多種化合物，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是其中含量最高、分布最廣且毒性最強的一種，已被國際癌癥研究機構（internationalagencyforresearchoncancer，IARC）認定為“2B”類致癌物[1-2]。OTA的分子式為C20H18ClNO6，它是由一個氯化的二氫異香豆素衍生物通過一個肽鍵與L-β-苯丙氨酸的7-羧基反應衍生出的一種穩定的無色結晶化合物[3]，其結構如圖1所示。OTA見光易分解，若接觸紫外線幾天就會分解，其易溶于極性有機溶劑和稀酸溶液，微溶于水。OTA耐熱性強，蒸煮不能破壞其毒性，焙烤也只能減少20%的毒性[4-6]。

圖1 赭曲霉毒素A化學結構式Fig.1 Chemical structure of ochratoxin A

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種重要的食品發酵菌株，廣泛應用于檸檬酸發酵生產，30多種酶制劑制備及重要蛋白的異源表達[7]。早在1987年，黑曲霉就被美國食品藥品監督局（food and drug administration，FDA）列為食品安全菌種（generally recognized as safe，GRAS）[8]，但是近年來，陸續在葡萄、葡萄酒、咖啡豆和多種谷物中發現了可以產生OTA的黑曲霉[9-12]，其安全性開始受到質疑。

OTA研究所用的培養基均為天然培養基（其中含有酵母提取物）[13]。該類培養基的成分復雜，碳源和氮源豐富，使用這種富營養型培養基研究黑曲霉產OTA代謝和產毒機制，在分析代謝產物時會受到培養基中其他物質的干擾，影響了對實驗結果進行定性和定量分析，而合成培養基可以彌補這個缺點[14]。通過對合成培養基組分的研究，確定了碳源和氮源及培養條件，有利于代謝和產毒機制的研究[15-16]。本研究以不同濃度的化學成分已知的碳源和氮源，進行OTA合成培養基成分的篩選優化，確定黑曲霉產OTA合成培養基的組成成分及培養條件，為黑曲霉產OTA合成與代謝的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產OTA黑曲霉菌株1062：由葡萄園中篩選得到。

基礎培養基（basalmedium，BM）：FeSO4·7H2O0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Na2HPO4·2H2O 0.5 g/L，KCl 1 g/L。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。

氨基酸母液：苯丙氨酸、丙氨酸、組氨酸、脯氨酸配成0.05 g/L和0.3 g/L母液，0.22 μm濾器過濾除菌，接種前加入培養基中。

赭曲霉毒素A標品（純度為98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜（high performance liqiud chromatographg，HPLC）儀帶G1321A熒光檢測器（fluorescence detector，FLD）：Agilent科技有限公司；5418R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；LRH-250-A生化培養箱：韶關市泰宏醫療器械有限公司；BS124S分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；DHG-9145A鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將黑曲霉1062菌株接種于PDA培養基，25℃培養5 d，無菌生理鹽水沖洗平板表面收集孢子，用滅菌的紗布過濾，取100 μL稀釋100倍并用血球計數板計數，調整菌懸液孢子的濃度至1.0×106個/mL。

1.3.2 合成培養基中碳源的篩選

BM培養基中加入不同碳源，分別為蔗糖18 g/L+葡萄糖1 g/L，阿拉伯糖10 g/L、果糖10 g/L、葡萄糖10 g/L、蔗糖10 g/L、阿拉伯糖100 g/L、果糖100 g/L、葡萄糖100 g/L、蔗糖100 g/L；氮源為0.3 g/L苯丙氨酸；調整合成培養基pH值為7。接種200 μL濃度為1.0×106個/mL的孢子懸液，25℃避光培養7 d后取樣進行檢測。

1.3.3 合成培養基中氮源的篩選

BM培養基中加入不同氮源，分別為（NH4）3PO40.3g/L+ NH4NO30.2 g/L、苯丙氨酸0.05 g/L、丙氨酸0.05 g/L、組氨酸0.05g/L、脯氨酸0.05g/L、苯丙氨酸0.3g/L、丙氨酸0.3g/L、組氨酸0.3 g/L、脯氨酸0.3 g/L；碳源為100 g/L葡萄糖；調整合成培養基pH值為7。加入200 μL濃度為1.0×106個/mL的孢子懸液，25℃避光培養7 d后取樣進行檢測。

1.3.4 培養條件優化

（1）用H2SO4或NaOH將合成培養基初始pH值分別調節至3～11，梯度值為1，接種200 μL濃度為1.0×106個/mL的孢子懸液，25℃避光培養7 d后取樣進行檢測。

（2）用H2SO4或NaOH將以上合成培養基初始pH值調節為7，200 μL濃度為1.0×106個/mL的孢子懸液接種于以上合成培養基，分別置于25℃、30℃、35℃培養箱避光培養7 d后取樣進行檢測。

（3）用H2SO4或NaOH將以上合成培養基初始pH值調節為7，200μL濃度為1.0×106個/mL的孢子懸液接種于以上合成培養基，25℃避光培養3～10d，每天取樣進行檢測。

1.3.5 測定方法

將10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL的OTA標準液經高效液相色譜儀檢測后繪制標準曲線。

（1）樣品處理：抽濾法收集菌體烘干后稱質量，量取剩余發酵液體積經0.22 μm濾器過濾并利用HPLC-FLD檢測OTA含量，最終得到OTA產量與菌體干質量的比值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程的建立

圖2 OTA標準品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC figure of ochratoxin A standard

OTA標準品的高效液相色譜圖見圖2。以峰面積（y）為縱坐標，OTA含量（x）為橫坐標，繪制標準曲線見圖3。

圖3 OTA標準曲線Fig.3 Standard curve of OTA

由圖3可知，所得標準曲線線性回歸方程為y=0.1362x-0.253 7，相關系數R2=0.995 8，表明二者線性關系良好。

2.2 合成培養基碳源的確定

表1 碳源對OTA的產量的影響Table 1 Effect of carbon sources on OTA production

由表1可知，當碳源為100g/L葡萄糖時OTA產量最高，為（2.72±0.04）μg/g，碳源為100g/L果糖時OTA產量最低為（1.07±0.03）μg/g。可能是因為葡萄糖易于吸收，可以使菌體快速生長，7d可以積累更多OTA。當碳源添加量為10 g/L時，OTA產量分別為（1.25±0.05）μg/g、（1.34±0.04）μg/g、（1.28±0.06）μg/g、（1.48±0.06）μg/g，除果糖外，OTA產量均低于碳源添加量為100 g/L時的產量。因此，合成培養基的碳源為100 g/L葡萄糖時最佳。

2.3 培養基氮源的確定

由表2可知，當添加0.3 g/L苯丙氨酸為氮源時產量最高，為（2.72±0.04）μg/g。添加0.05 g/L組氨酸為氮源時，OTA產量最低為（1.05±0.04）μg/g。可能是由于苯丙氨酸是OTA前體物質，OTA積累早于其他氨基酸，第7天積累OTA比較多。苯丙氨酸、丙氨酸、組氨酸、脯氨酸添加量為0.05g/L時，OTA產量分別為（1.85±0.06）μg/g、（1.47±0.06）μg/g、（1.05±0.04）μg/g、（1.13±0.02）μg/g，均低于氮源添加量為0.3 g/L時。無機氮源與有機氮源對OTA產量差異不大，說明黑曲霉1062既可以利用有機氮源，又可以利用無機氮源產生OTA。因此，合成培養基的氮源為0.3 g/L苯丙氨酸時最佳。

表2 氮源對OTA的產量的影響Table 2 Effect of nitrogen sources on OTA production

2.4 培養基初始pH的確定

1.增設買賣人體器官罪。如前所述，美、英、澳、日等國均在刑法上規定了禁止器官買賣的犯罪。為有力打擊器官移植相關犯罪，我國也應增設買賣人體器官罪，規定適當刑罰。

圖4 初始pH對OTA產量及菌體生物量的影響Fig.4 Effect of pH on OTA production and biomass

由圖4可知，當初始pH＜4時，黑曲霉1062菌株不能生長；當初始pH值為6時菌體生物量最多，但此時OTA的產量不是最高；當培養基的初始pH值為7時，OTA的產量相對于其他pH有較大的提升，OTA產量為2.82 μg/g，此時菌體生物量為2.0g。因此，合成培養基的初始pH值為7時最佳。

2.5 培養溫度的確定

通常來說酶反應速率會隨著溫度升高而增高，但過高的溫度可能導致代謝通路的改變、酶活力的喪失致使關鍵基因表達量下降或不表達。另外菌體的最適生長溫度和最佳產毒溫度不一定相同，研究發現黑曲霉的最適生長溫度為37℃，但OTA的產生溫度大多為15～30℃。本實驗利用合成培養基對黑曲霉1062菌株發酵生產OTA的最適溫度進行了研究，結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著培養溫度的升高，菌體生物量明顯增加，菌體生長加快，但OTA的產量下降，可見最適生長溫度并不是最佳產OTA溫度，這可能是由于溫度升高抑制了代謝通路中相關酶的活力，導致產OTA的能力下降。在培養溫度為25℃時OTA產量最高為2.84 μg/g，此時菌體成長量為2.1 g。因此，培養溫度為25℃時最佳。

圖5 培養溫度對OTA產量及菌體生物量的影響Fig.5 Effect of culture temperature on OTA production and biomass

2.6 培養時間的確定

研究培養時間對OTA產量及菌體生物量的影響，結果見圖6。

圖6 培養時間對OTA產量及菌體生物量的影響Fig.6 Effect of culture time on OTA production and biomass

由于霉菌在靜置條件下前期生長緩慢，菌體量較少，所以從第3天開始取樣。由圖6可知，菌體量在6～8 d時增長迅速，隨著時間的延長菌體量不斷增多，OTA產量在第8天達到最大值為4.19 μg/g，此時菌體生物量為3.4 g，此后產量相對于生物量不斷減少。分析原因可能是由于OTA被降解為相關代謝物赭曲霉毒素α（ochratoxia α，OTα）[18]；也可能是菌體在后續生長過程中與OTA合成相關的基因表達量下降。像這樣類似的結果在GALLO A等[19]研究炭黑曲霉中與OTA合成相關的pks基因的特性中也有出現。因此，培養時間為8 d時最佳。

3 結論

本研究獲得了黑曲霉產OTA最適全合成培養基成分為FeSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，苯丙氨酸0.3 g/L，Na2HPO4·2H2O 0.5 g/L，KCl 1 g/L，葡萄糖100 g/L。在培養條件為初始pH值為7時，25℃培養8 d，OTA產量為4.19 μg/g，菌體生物量為3.4 g。

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Development and optimization of the synthetic medium composition for ochratoxin A production byAspergillus niger

ZHU Liuyang1,CHEN Haoyu1,LI Min1,ZHU Xiaojuan1,GAO Huimei2,ZHANG Ying3,ZHANG Jian1,2*
(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;2.Tianjin SF-Bio Industrial Bio-tec Co.,
Ltd.,Tianjin 300462,China;3.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

For the current situation,there is no suitable synthetic medium for ochratoxin A(OTA)production byAspergillus niger,so the defined medium was designed and the culture conditions was optimized,to provide the basis for future research on OTA metabolism and toxin production mechanisms inA.niger.The nitrogen sources and carbon sources used in the synthetic medium were screened,and the OTA production of the medium in different time,pH and temperature conditions was detected by HPLC-FLD,to determine the optimal culture condition.Results showed that the optimal medium composition was FeSO4·7H2O 0.01 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,Na2HPO4·2H2O 0.5 g/L,KCl 1.0 g/L,glucose 100 g/L, phenylalanine 0.3 g/L.The optimal culture condition was pH 7,temperature 25℃,time 8 d.At the condition,the maximum OTA yield was 4.19 μg/g and the biomass was 3.4 g.

ochratoxin A;Aspergillus niger;synthetic medium;culture conditions

Q815

0254-5071（2017）02-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.028

2016-09-13

天津市企業博士后創新項目擇優資助計劃資助項目(2015)；天津市資助選派優秀博士后國際化培養計劃資助項目(2014)；國家自然科學基金(No.31471725，31370075，31201354)

朱柳楊（1991-），男，碩士研究生，研究方向為輕工技術與工程。

*通訊作者：張健（1978-），男，副研究員，博士，研究方向為真菌毒素。