si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對肝癌耐藥細胞Huh-7/ADM惡性行為的影響和機制

王菁 王振杰 伍淑娟

(1濮陽醫(yī)學高等專科學?；A醫(yī)學部，河南 濮陽 457000；2濮陽市人民醫(yī)院風濕內(nèi)科)

肝癌發(fā)病率不斷增長，其治療以手術、化療、放療等為主〔1〕。紫杉醇是肝癌化療的常用藥物，但肝癌細胞對紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生常導致肝癌化療失敗〔2〕。因此，預防和逆轉肝癌耐藥十分必要。貓眼綜合征臨界區(qū)基因(CECR)7是一種在肝癌中表達升高且與患者腫瘤等級、TNM分期及總生存率密切相關的長鏈非編碼RNA(lncRNA)〔3〕，但其對肝癌細胞耐藥性的影響及還未知。生物信息學軟件預測顯示，CECR7與miR-197可能存在靶向調控關系。miR-197是肝癌組織中表達降低的一個微小RNA(miRNA)，其高表達的患者整體生存率高于低表達患者，miR-197可作為肝癌早期診斷的生物標志物〔4〕；同時，miR-197可通過靶向抑制鋅指蛋白(ZIK1)的表達抑制肝癌細胞侵襲〔5〕。但是，miR-197對肝癌細胞耐藥性的影響也還未知。本研究主要探究了CECR7小干擾RNA(si-CECR7)聯(lián)合紫杉醇對肝癌紫杉醇耐藥Huh-7細胞(Huh-7/ADM)惡性行為的影響及其能否通過調控miR-197發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 肝癌細胞Huh-7及紫杉醇耐藥細胞Huh-7/ADM(中國科學院上海細胞庫)；紫杉醇(北京協(xié)和藥廠)每支30 mg/ml；胎牛血清(浙江天杭)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒、四甲基噻唑藍(MTT)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(北京索萊寶)；PCR實驗相關試劑盒(大連寶生物)；引物序列、miR-144-3p模擬物(mimics)及模擬對照序列(miR-NC)、si-CECR7及小干擾RNA陰性序列(si-NC)、miR-197抑制劑(anti-miR-197)及陰性序列(anti-miR-NC)、野生型(WT)和突變型(MUT)的CECR7熒光素酶報告載體(上海吉凱基因公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司)；蛋白質印跡實驗相關抗體(中國Abcam公司)。

1.2臨床資料 56例肝癌選自2016年3月至2018年11月于濮陽市人民醫(yī)院確診并行手術治療的患者，男39例，女17例，平均年齡(62.31±6.49)歲。術中留取患者癌組織和癌旁組織，液氮保存。納入標準：術前均未接受治療。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) Huh-7和Huh-7/ADM細胞均用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

1.3.2MTT實驗 于96孔板中接種Huh-7和Huh-7/ADM細胞，接種個數(shù)均為5.0×104個/孔。培養(yǎng)12 h后，均用含12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml〔6〕紫杉醇的培養(yǎng)基干預48 h。然后加5 g/L的MTT(20 μl/孔)，孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加二甲基亞砜(150 μL/孔)，振蕩均勻。將96孔板放置在酶標儀卡槽中，490 nm測吸光度(A)值。細胞抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。計算紫杉醇對每組細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CECR7和miR-197表達 ①在液氮保護下，用Trizol試劑提取組織樣本中總RNA。②于6孔板中接種Huh-7和Huh-7/ADM細胞，接種個數(shù)均為1.0×105個/孔，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，用Trizol試劑提取組織樣本中總RNA。將組織和細胞中RNA均逆轉錄為cDNA，進行擴增。引物序列：CECR7上游5′-GAGATGGATAGCGCTCGA-3′，下游5′-AACCGTGACGAAC GTTCC-3′；miR-197上游5′-CCGTACGGGCAATGCAAC-3′，下游5′-GTGCCAACGTACGGTCGAG-3′；GAPDH上游5′-GACCCCCATGACCTCAAC-3′，下游5′-CTCCTCAGTGTGGTGAAGA-3′；U6上游5′-GAGTGCGACTGACGTAGTACCG-3′，下游5′-CGTGTCCAAGGCCTGTTCACGCG-3′。2-△△Ct法計算CECR7相對GAPDH、miR-197相對U6的表達。

1.3.4細胞轉染 接種Huh-7/ADM細胞至6孔板中，接種個數(shù)為1.0×105個/孔。培養(yǎng)24 h后，將LipofectamineTM2000試劑分別與si-CECR7、si-NC、si-CECR7和anti-miR-NC、si-CECR7和anti-miR-197混合均勻，加至6孔板中(100 μl/孔)，孵育細胞12 h。qRT-PCR檢測CECR7或miR-197表達，驗證轉染效果后，用于后續(xù)實驗。

1.3.5細胞存活率檢測 MTT檢測細胞存活率。將轉染si-CECR7或si-NC、共轉染si-CECR7和anti-miR-NC、si-CECR7和anti-miR-197的Huh-7/ADM細胞均接種至96孔板中，接種個數(shù)均為5.0×104個/孔。培養(yǎng)12 h后，均用含12.5 μg/ml紫杉醇的培養(yǎng)基干預48 h，并分別記為紫杉醇+si-CECR7組、紫杉醇+si-NC組、紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-NC組、紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-197組。同時接種未轉染的Huh-7/ADM細胞，分別用含0.0(對照組)、12.5 μg/ml(紫杉醇組)紫杉醇的培養(yǎng)基干預48 h。然后按照上述1.3.2測定各孔A值。存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.3.6檢測細胞克隆形成能力檢測 克隆實驗檢測細胞克隆形成能力。將未轉染或轉染后的Huh-7/ADM細胞均接種至6孔板中，接種個數(shù)均為5.0×104個/孔。培養(yǎng)12 h后，均按照上述1.3.5分組處理。培養(yǎng)14 d后，棄培養(yǎng)基。顯微鏡觀察，統(tǒng)計超過50個細胞的克隆數(shù)。

1.3.7細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測細胞凋亡。將未轉染或轉染后Huh-7/ADM細胞，均接種至6孔板中，接種個數(shù)均為5.0×104個/孔。培養(yǎng)12 h后，均按照上述1.3.5分組處理。培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞，利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.8細胞遷移和侵襲檢測 Transwell檢測細胞遷移和侵襲。將未轉染或轉染后Huh-7/ADM細胞，均接種至6孔板中，接種個數(shù)均為5.0×104個/孔。培養(yǎng)12 h后，均按照上述1.3.5分組處理。培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞。遷移：將收集的各組細胞均接種至Transwell上室，接種個數(shù)均為2.5×104個/孔。另取500 μl完全培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基。將下室細胞進行固定和染色。顯微鏡觀察并計數(shù)。侵襲：將基質膠鋪于Transwell上室，干燥后，再接種細胞，后續(xù)操作同遷移實驗。

1.3.9細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和基質金屬蛋白酶(MMP)-2蛋白表達檢測 Western印跡法檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2蛋白表達。用RIPA試劑提取各組細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白含量。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗分離總蛋白，并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，于5 %脫脂牛奶中封閉1 h。然后將PVDF膜分別置于CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2一抗孵育液中，放置于4℃冰箱中孵育過夜。洗膜后，再置于山羊抗兔二抗中，置于37℃搖床中孵育2 h。滴加顯影液顯影，曝光拍照。

1.3.10CECR7與miR-197靶向關系驗證 雙熒光素酶報告基因實驗驗證CECR7與miR-197靶向關系。接種Huh-7/ADM細胞至6孔板中，接種個數(shù)為1.0×105個/孔。培養(yǎng)24 h后，將LipofectamineTM2000試劑分別與miR-NC(或miR-197mimics)和WT-CECR7、miR-NC(或miR-197mimics)和MUT-CECR7混合均勻，加至6孔板中(100 μl/孔)，孵育細胞12 h。收集細胞并裂解，將裂解液3500 r/min離心10 min。取100 μl 1×熒光素酶反應工作液，加20 μl離心后的上清液，混合均勻，檢測螢火蟲熒光強度。再加100 μl 1×海腎熒光素酶反應工作液，混合均勻，檢測海腎熒光強度。以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示細胞熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1紫杉醇對Huh-7/ADM細胞抑制率的影響 與對照組比較，紫杉醇組Huh-7、Huh-7/ADM細胞抑制率顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。紫杉醇對Huh-7、Huh-7/ADM細胞的IC50值分別為24.10 μg/ml、161.00 μg/ml，后者約是前者的6.7倍。見表1。

表1 不同濃度的紫杉醇對Huh-7/ADM細胞抑制率的影響

2.2肝癌組織和細胞系中CECR7表達水平 與癌旁組織(1.01±0.10)比較，肝癌組織中CECR7表達水平顯著升高(1.56±0.16，P<0.05)。與Huh-7細胞(1.01±0.10)比較，Huh-7/ADM細胞中CECR7表達水平顯著升高(2.09±0.21，P<0.05)。

2.3si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞增殖和凋亡的影響 CECR7在轉染si-CECR7的細胞中的表達量顯著低于轉染si-NC的細胞(0.25±0.04 vs 1.03±0.10，t=21.726，P<0.05)。對照組與紫杉醇組各檢測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。紫杉醇+si-CECR7組Huh-7/ADM細胞存活率、克隆數(shù)、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達均顯著低于紫杉醇+si-NC組(P<0.05)，而凋亡率、P21和Bax蛋白表達均顯著高于紫杉醇+si-NC組(P<0.05)。見圖1、圖2、表2、圖3。

2.4si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞遷移和侵襲的影響 對照組與紫杉醇組各檢測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。紫杉醇+si-CECR7組Huh-7/ADM細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)和MMP-2蛋白表達均顯著低于紫杉醇+si-NC組(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達顯著高于紫杉醇+si-NC組(P<0.05)。見圖4、表3、圖5。

1～4：對照組,紫杉醇組，紫杉醇+si-NC組，紫杉醇+si-CECR7組圖1 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

圖2 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞凋亡的影響

表2 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞增殖和凋亡的影響

圖3 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞克隆形成的影響(結晶紫染色，×50)

圖4 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞遷移和侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表3 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞遷移和侵襲的影響

1～4:對照組，紫杉醇組，紫杉醇+si-NC組，紫杉醇+si-CECR7組圖5 si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞遷移和侵襲蛋白表達的影響

2.5CECR7靶向調控miR-197表達 CECR7與miR-197的結合位點見圖6。共轉染miR-NC與WT-CECR7、miR-197與WT-CECR7的Huh-7/ADM細胞熒光素酶活性分別為0.93±0.09、0.20±0.02，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=23.754，P<0.05)；共轉染miR-NC與MUT-CECR7、miR-197與MUT-CECR7的Huh-7/ADM細胞熒光素酶活性分別為0.96±0.09、1.01±0.10，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.115，P=0.533)，說明CECR7靶向結合miR-197。此外，miR-197在轉染si-CECR7的Huh-7/ADM細胞中的表達量為2.46±0.15，顯著高于轉染si-NC的Huh-7/ADM細胞中的表達量(1.01±0.10，t=24.129，P<0.05)，說明CECR7負調控miR-197表達。

2.6anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 miR-197在共轉染si-CECR7與anti-miR-197的細胞中的表達量顯著低于共轉染si-CECR7與anti-miR-NC的細胞(0.36±0.04 vs 1.00±0.10，t=17.827，P<0.05)。紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-197組Huh-7/ADM細胞存活率、克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及CyclinD1、Bcl-2和MMP-2蛋白表達均顯著高于紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-NC組(P<0.05)，而凋亡率、P21、E-cadherin和Bax蛋白表達均顯著低于紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖7～9、表4和表5、圖10。

圖6 CECR7與miR-197的結合位點

圖7 anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞凋亡的影響

圖8 anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞克隆形成的影響(結晶紫染色，×50)

圖9 anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表4 anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞增殖、遷移、侵襲的影響

表5 anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞凋亡的影響

1,2:紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-NC組,紫杉醇+si-CECR7+anti-miR-197組圖10 anti-miR-197逆轉si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對Huh-7/ADM細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

化療是肝癌常用的治療方法，但肝癌細胞易對紫杉醇等化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導致化療失敗〔7,8〕。因此，降低肝癌細胞耐藥性對于提高肝癌化療療效具有積極意義。研究顯示，lncRNA參與調控腫瘤細胞的耐藥性〔9〕，探討影響腫瘤細胞耐藥性的lncRNA及其作用機制，可為降低腫瘤耐藥性提供分子靶點。例如，敲減lncRNA SNHG7降低卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性〔10〕；lncRNA OTU結構域蛋白酶6B反義RNA1(OTUD6B-AS1)通過調節(jié)miR-26a-5p/異黏蛋白(MTDH)通路促進三陰性乳腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性，通過敲減lncRNA OTUD6B-AS1可起到改善三陰性乳腺癌紫杉醇耐藥的作用〔11〕；lncRNA尿路上皮癌相關基因(AUCA)1在結腸癌中表達上調，敲減lncRNAUCA1可通過下調糖酵解酶己糖激酶2和乳酸脫氫酶A的表達增強結腸癌細胞對紫杉醇的敏感性〔12〕。

作為一種lncRNA，CECR7參與多種腫瘤的發(fā)展進程。王向輝等〔13〕研究顯示，食管癌細胞中CECR7表達升高，沉默CECR7可能通過抑制細胞周期蛋白依賴激酶4、CyclinD1和p21活化蛋白激酶2的表達抑制食管癌細胞的惡性行為，CECR7是食管癌治療的潛在新靶點。本研究主要探究了CECR7對肝癌細胞紫杉醇腦藥性的影響，結果顯示，CECR7在肝癌耐藥細胞株Huh-7/ADM中的表達水平高于肝癌細胞Huh-7，轉染si-CECR7聯(lián)合紫杉醇降低了Huh-7/ADM細胞的增殖、遷移及侵襲性，促進了細胞凋亡，同時降低了細胞中與增殖、凋亡、遷移和侵襲相關的蛋白CyclinD1、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的表達，而促進了P21和Bax蛋白表達，與相關報道結果一致〔14,15〕，說明si-CECR7可降低Huh-7/ADM細胞對紫杉醇的耐藥性，CECR7有可能成為改善肝癌細胞對紫杉醇耐藥的分子靶點。

miR-197是胃癌中下調的miRNA，其可通過靶向抑制CXCR6的表達阻礙胃癌的發(fā)展進程〔16〕；子宮內(nèi)膜癌中miR-197表達下調，上調miR-197可通過靶向抑制CTNND1/Wnt/β-catenin軸降低子宮內(nèi)膜癌細胞的惡性行為〔17〕。Wang等〔18〕研究顯示，miR-197可在體外和體內(nèi)顯著抑制肝細胞癌細胞的生長，可能是干擾肝細胞癌中白細胞介素6/信號轉導及轉錄激活因子3炎癥途徑的潛在治療靶標。本研究利用恢復實驗發(fā)現(xiàn)，轉染anti-miR-197逆轉了si-CECR7聯(lián)合紫杉醇對紫杉醇耐藥肝癌細胞惡性行為的影響，這提示CECR7可能通過靶向負調控miR-197來降低紫杉醇耐藥肝癌細胞對紫杉醇的耐藥性。

綜上所述，CECR7在肝癌耐藥細胞Huh-7/ADM中呈高表達，si-CECR7聯(lián)合紫杉醇抑制紫杉醇耐藥肝癌細胞的惡性行為，這可能與轉染si-CECR7引起細胞中miR-197的表達上調有關，但其具體作用的miR-197的靶基因還有待進一步探究，CECR7有可能成為改善紫杉醇耐藥肝癌細胞對紫杉醇耐藥性的分子靶點。