花椒屬環八肽Zanriorb A1的固相合成*

吳 也，凌保東,2，宋 麗，莫金秋，廖洪利,2△

1.成都醫學院 藥學院(成都 610083)；2.四川省高校結構特異性小分子藥物重點實驗室(成都 610083)

花椒屬環八肽Zanriorb A1的固相合成*

吳 也1，凌保東1,2，宋 麗1，莫金秋1，廖洪利1,2△

1.成都醫學院 藥學院(成都 610083)；2.四川省高校結構特異性小分子藥物重點實驗室(成都 610083)

目的 合成能夠誘導T淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡的花椒屬環八肽Zanriorb A1。 方法 通過9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法，以2-氯三苯基氯樹脂(CTC)為載體，Fmoc-Gly-OH為起始原料，N,N-二異丙基乙胺(DIEA)/6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)為縮合體系，在液相經1-羥基苯并三氮唑(HOBt)/苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸(PyBOP)/DIEA實現環合，所得化合物通過RP-HPLC、MS等光譜表征。 結果 通過本法順利得到純度>98%的花椒屬環八肽Zanriorb A1，總收率為48%。 結論 該合成方法具有可行性，操作簡單，總收率高，目標化合物可用于抗Jurkat細胞的藥物研究。

Zanriorb A1；花椒屬；Jurkat細胞；固相合成；環肽

蕓香科花椒屬，分布于熱帶和亞熱帶地區，有250多個種類。該類植物的樹葉和樹皮化學成分主要包括生物堿、酰胺、香豆素、木酚素及萜類等化合物[1]，具有消炎[2]、鎮痛[3]、解痙[4]和驅蟲[5]等藥理活性。Dos等[6]從花椒屬riedelianume的枯葉中分離得到一種新型環八肽Zanriorb A1，其能誘導T淋巴細胞白血病Jurkat細胞的凋亡(IC50 218 nM)，這是繼柑橘屬[7]、吳茱萸屬[8]和黃皮屬[9]之后，又一個蕓香科中具有生物活性的環肽，隨著環肽的重新定義[10],這一類分子正逐漸成為有前景的藥物研發途徑。

Zanriorb A1由8個氨基酸殘基構成，結構為：Cyclic[Gly-Phe-Phe-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly](圖 1)，相對分子質量為806.38 Da。國內外關于Zanriorb A1的化學合成未見文獻報道，本研究旨在通過Fmoc固相合成法，獲得目標產物，為其進一步的藥物開發提供原料，以及規模化制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：氣浴恒溫振蕩器(常州國宇儀器制造有限公司)；低溫冷卻循環泵(上海東璽制冷儀器設備有限公司)；LC-6A制備液相色譜儀、Prominence LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；6538 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS質譜儀(美國Agilent公司)。試劑：Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)、Fmoc-Phe-OH(苯丙氨酸)、Fmoc-Pro-OH(脯氨酸)、2-氯三苯基氯樹脂、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(上海吉爾生化有限公司)；N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸(PyBOP)、三氟乙酸(TFA)，乙腈(色譜純)(北京百靈威科技有限公司)；茚三酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶、甲醇均為分析純(國藥集團化學試劑北京有限公司)。

圖1 Zanriorb A1的化學結構式

1.2 方法

1.2.1 Zanriorb A1的直鏈合成 本研究首先合成Zanriorb A1的前體直鏈肽(圖2)。取2-氯三苯基氯樹脂500 mg(載樣量為0.20 mmol/g)加入到固相合成反應管中，用DCM浸泡20 min使樹脂充分溶脹，抽干待用。將Fmoc-Gly-OH(297 mg，1 mmol)和DIEA(365.0 μL，2 mmol)混溶于7 mL DMF，加入到樹脂中搖晃3 h，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次，然后加入7 mL MeOH反應20 min，封閉未反應的樹脂。樹脂洗凈后，加入20 %哌啶-DMF溶液10 mL，振蕩10 min×2脫去Gly上的Fmoc保護基，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次。隨后根據多肽序列將Fmoc-氨基酸(1 mmol)、HCTU(0.9 mmol)和DIEA(2 mmol)混溶于7 mL DMF，加入到樹脂中，分別振蕩1 h，重復脫保護→縮合→脫保護的操作步驟，依次偶聯Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH，直到所有氨基酸連接完成。縮合反應中通過Kaiser試劑(茚三酮定性顯色)監測反應進程。

圖2 Zanriorb A1的合成路線

1.2.2 直鏈肽的游離 直鏈完成后，將樹脂洗凈抽干，加入TFA∶DCM =1∶1(V/V)15 mL，室溫振蕩1 h，使直鏈肽與樹脂分離，過濾，用少許TFA洗滌樹脂，減壓濃縮濾液得直鏈肽粗品，對其進行HR-Q-TOF-MS(高分辨基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜)測試。

1.2.3 液相環合 將HOBt(5 eq)、PyBOP(5 eq)、DIEA(10 eq)和DMF(1 mL)溶于適量DCM中，氬氣置換3遍，于0 ℃緩慢滴入直鏈肽的DCM溶液，使得肽液的最終濃度為0.5 mg/mL。滴畢自然升至室溫攪拌，1 h后濃縮反應液即得Zanriorb A1粗品。

1.2.4 Zanriorb A1的分離純化和質譜鑒定 將粗肽用甲醇溶解，通過制備型反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)純化。制備柱色譜條件：Grace Vydac “Peptide C18”柱(250×10 mM，10 μM)；檢測波長214 nm；流動相A為0.1% TFA乙腈溶液，流動相B為0.1% TFA水溶液，梯度洗脫(0～40 min，流動相B：90%～0%)；流速4.0 mL/min。制備過程中收集主峰，冷凍干燥后即得目標產物，然后對Zanriorb A1純品進行HPLC分析和HR-Q-TOF-MS鑒定。

2 結果

2.1 Zanriorb A1純品的分析

所得Zanriorb A1純品39 mg，狀態為白色粉末，總收率為48%。采用RP-HPLC對其進行純度和含量的測定，并對液相流出曲線中的色譜峰面積定量積分。結果顯示：除去5 min以前的溶劑峰，另外3個色譜峰的保留時間分別為17.422、20.734和21.799 min，峰面積比分別為0.434%、98.979%和0.595%(圖3、表1)，故樣品純度>98%。HPLC分析條件：分析柱：Grace Vydac “Protein & Peptide C18”(250 × 4.6 mM, 5 μM)；檢測波長214 nm；流動相A為0.1% TFA乙腈溶液，流動相B為0.1% TFA水溶液，梯度洗脫(0～35 min，流動相B：90%～0%)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

>圖3 Zanriorb A1純品的HPLC圖

表1 Zanriorb A1純品的HPLC定量分析

2.2 Zanriorb A1環合前后的質譜分析

經HR-Q-TOF-MS鑒定，環合前的Zanriorb A1直鏈肽的理論分子量為[M+H]+=825.39，[M+Na]+=847.39，實際分子離子峰為[M+H]+=825.3946，[M+Na]+=847.3766(圖4)，理論分子量和實際分子量相差在正負1之間，故可認為所合成的Zanriorb A1直鏈肽正確。同理，環合后化合物脫去一分子水，分子量減少18，計算終產物理論分子量為[M+H]+=807.38，而上述所測純度>98%的Zanriorb A1純品質譜實際觀測值為[M+H]+=807.3836(圖5)，與理論值相符，說明所得即為Zanriorb A1。

圖4 Zanriorb A1直鏈肽的HR-Q-TOF-MS圖

圖5 Zanriorb A1純品的HR-Q-TOF-MS圖

3 討論

以富集脯氨酸為代表的生物活性環肽可以作為一種潛在的新型抗腫瘤候選藥物，研究[11-12]發現，脯氨酸基團在定義環肽構象和提供細胞毒機制方面有著重要的意義，這類化合物能夠直接作用于Jurkat細胞的細胞膜，使細胞發生凋亡。Zanriorb A1是該類細胞毒性和凋亡活性較高的新型環肽，但由于自然界中花椒屬riedelianume體內含有的Zanriorb A1非常少(3 kgriedelianume枯葉中僅分離得到16 mg的Zanriorb A1[6])，且成分復雜，如何提取分離成為研究Zanriorb A1前期必須解決的一道難題。

本研究首次采用Fmoc多肽固相合成法，對Zanriorb A1的全合成進行了研究。在Zanriorb A1的序列中，苯丙氨酸和脯氨酸所在位置均是環合位阻較大的位點，而2個甘氨酸之間位阻最小，更加容易環合；并且選用沒有光學活性的甘氨酸為C端殘基，能夠減小多肽合成中消旋的風險，提高合成產率。Zanriorb A1的合成載體采用了CTC樹脂。該樹脂滿足以下條件：負載在其上的多肽分子切割后可直接生成端基為羧基的多肽，符合環肽的合成需要；甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和絲氨酸等如果處在C端第1位或第2位時，發生分子內胺解環化的傾向極強，繼而導致載體的連接基團發生斷裂，肽鏈合成無法繼續進行，而CTC樹脂結構上的位阻效應可以避免這種情況的發生[13]；以CTC樹脂作為載體，省時省力，經濟實惠，適合工業化生產。 氨基酸縮合常用的體系有DCC-HOBt、DIC-HOBt、TBTU-DIEA、HATU-DIEA、HCTU-DIEA、PyAOP-HOAt-DIEA和PyBOP-HOBt-DIEA等。其中HCTU和PyBOP體系縮合效率高，反應速度快，不易發生消旋，且廉價易得，有潛在的工業應用價值，故在本研究直鏈合成的過程中選擇HCTU-DIEA，環合反應的關鍵步驟優選PyBOP-HOBt-DIEA為縮合試劑，并且取得了良好的效果。

綜上所述，在本研究的合成工藝下，所得Zanriorb A1純度>98%，總收率為48%。其結構經質譜確證，合成方法簡單易行，反應條件溫和，總收率高，合成得到的目標化合物為其進一步的藥理學、藥效學研究提供原料，并為其規模化生產提供參考。

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The Solid-phase Synthesis of Zanriorb A1 of Zanthoxylum Cyclic Octapeptide

WuYe1，LingBaodong1,2,SongLi1,MoJinqiu1，LiaoHongli1,2△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.KeyLaboratoryofSmallMoleculeSpecialStructureDrugsofSichuanInstitutionofHigherEducation,Chengdu610083,China

Objective To synthesize the Zanriorb A1 of zanthoxylum cyclic octapeptide which can induce the apoptosis of Jurkat cells. Methods The Fmoc solid-phase polypeptide synthesis (SPPS) was used with 2-chlorotrityl chloride resin as a solid support, Fmoc-Gly-OH as the starting material, and DIEA/HCTU as a condensation system. The cyclization was achieved in the liquid phase by HOBt/PyBOP/DIEA, and the target peptide was confirmed by RP-HPLC and MS. Results The Zanriorb A1 of zanthoxylum cyclic octapeptide was synthesized with the final purity of over 98% and the overall yield of 48%. Conclusion The synthetic method was feasible, simple and practical with high yield, and the desired target peptide could be used for drug screening of anti-Jurkat cells.

Zanriorb A1; Zanthoxylum; Jurkat cells; Solid-phase synthesis; Cyclic peptide

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1045.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.010

四川省高校科研創新團隊項目資助(No:13TD0028)

R79；R914.5

A

△通信作者：廖洪利，E-mail：liaohl213@126.com