論牛冷凍精液人工授精技術(shù)

單曲拉姆 澤旺曲珍 索朗曲吉

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)拉薩市尼木縣吞巴鄉(xiāng)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏拉薩 850000）

論牛冷凍精液人工授精技術(shù)

單曲拉姆1澤旺曲珍2索朗曲吉1

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)拉薩市尼木縣吞巴鄉(xiāng)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏拉薩 850000）

牛冷凍精液人工授精是一項具有重大科學價值的繁殖新技術(shù)，它是建立在家畜育種工作的迫切需要和人工授精技術(shù)高度發(fā)展基礎(chǔ)上的。近代生理學、生物化學、分子生物學、低溫學、化工學、電子學以及超聲波技術(shù)的進展，為精液的冷凍保存，運輸和使用技術(shù)，提供了現(xiàn)代化的技術(shù)裝備。該項技術(shù)不僅在畜牧生產(chǎn)上獲得了顯著的效益和廣泛的應(yīng)用，而且迅速擴大到其它生物貯存和其它科學領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生等。

1 牛冷凍精液的生產(chǎn)程序

要生產(chǎn)出高質(zhì)量冷凍精液，除了引進或選留優(yōu)良公牛及科學的飼養(yǎng)管理以外，在凍精生產(chǎn)過程中必須嚴格操作規(guī)程。現(xiàn)將其生產(chǎn)程序作一介紹：

根據(jù)生產(chǎn)性能的需要選留種公牛并進行科學的飼養(yǎng)管理，等至合適的年齡時，即可進行采精調(diào)教至正式生產(chǎn)，其工藝流程為：采精器械準備及稀釋液的配制→人工采集精液→鮮精活力鏡檢 0.6級以上→鮮精液稀釋2－4倍→降溫平衡→鏡檢平衡后活力→制凍→鏡檢凍后活力0.3級以上→分裝貼標→保存→輸精。

2 液氮、凍精的保存及運輸

液氮、凍精均存放于低溫生物容器（液氮罐）內(nèi)，液氮罐是用不銹鋼或鋁合金制成的雙層外壁容器，內(nèi)外兩層中間為高度真空并填有絕熱材料，容器蓋用泡沫塑料制成，即可少量透氣，又有隔熱作用。因為液氮的沸點很低（ -195.8℃），所以往空罐內(nèi)填充液氮時，開始要緩慢少量，待罐內(nèi)溫度降低后，再逐步加大流量及速度，液氮、凍精貯存罐每年倒空1－2次自然放置60－70小時，使罐內(nèi)溫度回升到常溫，然后用清水沖洗干凈，并加以干燥。

液氮罐內(nèi)有精液貯存時，注意當液氮耗量達到60－70%時。就要補充液氮，防止因缺少液氮而使罐內(nèi)溫度回升導致精子死亡。貯存液氮和凍精的液氮罐應(yīng)放置在陰涼、干燥、通風透氣條件較好的房間內(nèi)。運輸液氮和凍精時，嚴禁用任何物品將罐口封嚴，以堵塞液氮的自然揮發(fā)量而使罐內(nèi)產(chǎn)生較高壓力而發(fā)生沖爆事故、危及安全。不論使用何種交通工具運輸液氮和凍精，均不得嚴閉車窗口，因為罐內(nèi)液氮隨時地都處于微量自然揮發(fā)狀態(tài)，如通風透氣條件不好，則室內(nèi)空氣中氮氣含量增加，氧氣含量減少，會造成乘坐人員因缺氧而發(fā)生窒息事故。

3 凍精液的解凍技術(shù)和解凍方法

冷凍精液的解凍過程與冷凍過程比較，雖然方法簡單，速度快，時間短，但同樣重要，解凍的溫度變化與冷凍相反，溫度是由低到高，同樣應(yīng)避免或減少在通過結(jié)晶危險溫度區(qū)精子細胞膜內(nèi)發(fā)生變化而對精子造成損傷甚至死亡。

3.1 顆粒凍精的解凍技術(shù)和解凍方法

1）解凍液的配制

我省目前使用的解凍液為2.9%的檸檬酸鈉（Na3C6H5O7、2H2O）溶液，大部分人工授精站都是統(tǒng)一從省育種站購買，也有少部分地區(qū)自制生產(chǎn)，不論是購買或自己配制，都必須嚴格生產(chǎn)過程中的操作規(guī)程。統(tǒng)一配方并調(diào)定準確有關(guān)參數(shù)（PH值，滲透壓）。現(xiàn)將配方及配制方法介紹如下：

準量稱取檸檬酸鈉 2.9克，放入玻璃量筒內(nèi)加蒸餾水至100毫升刻度，混合均勻，測定PH值為7.33，滲透壓290.3，經(jīng)定量濾紙過濾，分裝于安瓿內(nèi)，每只安瓿內(nèi)的凈溶量為1.5毫升，用酒精燈火焰封口，然后置于高壓消毒鍋中消毒滅菌（蒸氣1.06－1.4kg/cm2，消毒時間為20－40分鐘，蒸氣溫度為121－126℃），保存在陰涼干燥處待用，有效期為6個月。安瓿解凍液的優(yōu)點是便于保管，衛(wèi)生，能減少外界環(huán)境污染，取用方便。據(jù)了解，有的單位使用的解凍液是自行配制后盛裝于三角燒瓶中保存?zhèn)溆茫@種方法保存的時間短，接觸外界污染機會多，取用不便，而且質(zhì)量很難保證。建議各地使用安瓿法解凍液，以保證凍精解凍后的質(zhì)量。

2）解凍溫度

冷凍精液的解凍溫度分為快速解凍（40℃），室溫解凍（15－20℃），冷水（4－5℃）緩慢解凍三種方法。目前世界上大部分地區(qū)都采用35－40℃這個溫度范圍解凍，實踐證明，采用40℃快速解凍精子復(fù)蘇率較高，且活力較強。

3）解凍技術(shù)操作

解凍過程中必須嚴格各個環(huán)節(jié)的操作過程，注意以下事項：a、凍精離開液氮面與放入解凍液中的速度一定要快取快放，盡量縮短空間停留時間；b、顆粒凍精上不得粘附凍霜，如有應(yīng)稍加振動，使其脫落后再行解凍；c、解凍過程的各個環(huán)節(jié)，必須嚴格控制環(huán)境污染；d、夾取顆粒凍精的金屬鑷子要經(jīng)預(yù)冷后再夾取凍精，以防止顆粒凍精粘附在鑷子上難以脫落。

3.2 解凍具體操作步驟

首先將恒溫容器（電熱恒溫水溶鍋或廣口保溫杯）內(nèi)的水溫調(diào)至 40℃±2℃，將裝有解凍液的安瓿放入溫水內(nèi)，等其溫度與恒溫水大約相等時，即將安瓿拿出，用消毒紗布抹去安瓿周圍的水分，再用安瓿開口器或金屬鑷子將安瓿尖端開口，口徑大小以能放入一顆凍精為宜，然后夾取一顆凍精放入安瓿的三分之二，在水中輕緩游動，使安瓿內(nèi)的顆粒凍精溫度均勻上升，游動安瓿時必須特別小心，絕對不能將恒溫水振入安瓿內(nèi)，觀察顆粒大約溶解至80－90%時，即可將其拿出水面，再次用消毒紗布擦去安瓿周圍的水分，并略加搖動，使精液完全溶解，混合均勻，然后在20℃左右溫度的顯微鏡下檢查精子活力情況，如有效精子（呈直線前進運動的精子）的活力在0.3級以上，即可用于輸精。

3.3 細管凍精的解凍技術(shù)和解凍方法

在使用細管精液過程中，首先必須按照冷凍精液的規(guī)程操作，雖然細管凍精不易受外界環(huán)境污染，但標準化、規(guī)范化的技術(shù)操作也是確保受胎率，避免生殖系統(tǒng)感染病菌的重要措施。

1）檢查細管體

細管凍精從液氮中取出后，首先檢查細管體是否有裂紋和封口不嚴的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)有裂紋者，該支細管凍精應(yīng)棄之不用，如屬封口不嚴，則解凍時可封口不嚴的一端朝上放入40℃左右的恒溫水中進行解凍，盡量避免因解凍方法不當而導致解凍后精子活力不強乃致死亡的人為因素。

2）解凍

首先準備 40℃左右的恒溫水，恒溫容器的準備與顆粒凍精解凍法介紹的相同，細管凍精從液氮中取出后，手拿細管上端（封裝精液后封口），立即放入恒溫水中并輕緩游動，以保持其管壁受熱均衡。經(jīng)20－30秒鐘后即可解凍完畢。目前全國各地較為普遍使用此種解凍方法的解凍效果好且受胎率高，除此種方法外，也有其它幾種方法可供參考，但不提倡廣泛使用。

S858．23

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1003-1650(2017)04-0251-01