肥胖伴牙周感染小鼠體內B- 1a細胞的表達初探

王軼雄 余挺 謝寶儀 軒東英 章錦才

B- 1a細胞能夠分泌抵御病原體入侵的多反應性低親和力抗體[1-2]，還可以在不受外界刺激的情況下分泌IL- 10、IL- 3等免疫調節分子[3-5]，這些抗體和分子可以在動脈粥樣硬化、自身免疫病等炎癥疾病的免疫機制中發揮作用。但是尚未有學者對肥胖機體內是否存在B- 1a細胞和其發揮的機制做過相關研究。

牙周炎能夠造成牙齒周圍組織破壞[6]。有學者發現，牙周炎病損部位有大量B- 1a細胞浸潤[7-8]，并在受損的牙齦組織中進一步發現了B- 1a細胞分泌的抗Col- Ⅰ抗體[9-11]。本研究建立肥胖伴牙周感染小鼠模型，應用免疫組化染色、實時定量PCR、蛋白質印跡3 種方法對頜骨與脾臟[12]內的B- 1a細胞膜表面特異性蛋白CD5[13]，及其分泌的抗Col- Ⅰ抗體和IL- 10炎癥因子的蛋白表達和mRNA表達情況進行定量分析，從牙周局部到機體臟器，初步探究肥胖與牙周炎、B- 1a細胞三者之間的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

6 周齡雄性C57BL/6J小鼠(廣東省醫學實驗動物中心)；60%高脂飼料和10%低脂飼料；Real time PCR儀(Mx3000P,Agilent公司,美國)；SDS- PAGE垂直電泳槽(北京凱元伯樂生物科技有限公司)；Image Pro Plus 數字化拍攝系統。

1.2 實驗模型誘導

24 只小鼠隨機分成2 組，每組12 只。一組喂高脂飼料，為肥胖組(high fat diet，HF)，另一組喂低脂飼料，為標準組(low fat diet，LF)，飼料誘導30 周后[16]，從HF組和LF組中隨機抽取6 只做牙周真性結扎處理(牙周炎組，periodontitis，P)，每組剩余的6 只做假性結扎處理(對照組，control，C)，結扎處理5 d[17]，隨即產生標準伴牙周假性結扎組(LFC組)、標準伴牙周真性結扎組(LFP組)、肥胖伴牙周假性結扎組(HFC組)、肥胖伴牙周真性結扎組(HFP組)。無菌條件下將上述4組小鼠的脾臟取出，并將其上頜骨分離。

1.3 頜骨免疫組化染色定量分析

對頜骨進行組織處理，抗原熱修復后用30 ml/L過氧化氫避光孵育25 min，PBS 5 min×3 次，山羊血清工作液封閉30 min后分別加入IL- 10(小鼠一抗1∶200)(Abcam公司)、CD5(大鼠抗1∶100)(NOVAS公司)、抗Col- Ⅰ抗體(兔抗1∶100)(Abcam公司)4 ℃冰箱過夜；孵二抗(DAKO公司)；顯微鏡下DAB顯色，復染胞核，10%鹽酸乙醇分化后透明、脫水、樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。用圖像處理系統(Image- Pro Plus 6.0)分析圖片凈光密度值。

1.4 實時定量PCR基因水平檢測

將組織在液氮中研磨后加入Trizol試劑提取RNA，逆轉錄合成cDNA，引物序列見表 1。取1.0 μl的cDNA在20 μl的反應體系中進行實時定量PCR擴增。用甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，通過2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct-Ctβ-肌動蛋白，△△Ct=△Ct缺氧-△Ct對照，Ct為循環次數)方法檢測各基因相對表達量。每個樣品均設定5 個平行復孔，取平均值。

1.5 蛋白質印跡法蛋白定量分析

將脾臟組織剪碎，加入裂解液提取總蛋白。經SDS- PAGE電泳分離，轉膜。胎牛血清封閉1 h，分別加入IL- 10(小鼠一抗1∶500)、CD5(大鼠抗1∶500)、抗Col- Ⅰ抗體(兔抗1∶20 000)，4 ℃孵育過夜，分別加入相同的二抗(山羊抗兔IgG 1∶20 000)，搖床室溫下1 h，PVDF膜后膠片顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統(Image- Pro Plus 6.0)分析條帶凈光密度值。

1.6 統計學處理

表 1 實時定量PCR目的基因引物序列及長度

2 結 果

2.1 肥胖和牙周炎對頜骨中B- 1a細胞的標記

CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10少量表達于LFC和HFC組的牙齦結締組織與上皮，但在LFP與HFP組中大量表達。P組中的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體表達量顯著高于C組(P<0.001)。

P組中LF組的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體表達量未顯著高于HF組(P>0.05)(圖 1～2)。

2.2 頜骨中CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10的mRNA表達

P組中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的mRNA表達量顯著高于C組(P<0.001)。

P組中LF組的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的mRNA表達量未顯著高于HF組(P>0.05)(圖 3)。

2.3 肥胖和牙周炎對脾臟中B- 1a細胞的標記

HF組中CD5表達量顯著高于LF組(P<0.001)；IL- 10表達量顯著高于LF組(P=0.002)。

抗Col- Ⅰ抗體表達分析顯示：在HF組中P組與C組之間的蛋白表達量無統計學差異(P>0.05)，但在LF組中P組蛋白表達量顯著高于C組(P<0.05)；在P組中HF組與LF組之間的蛋白表達量無統計學差異(P>0.05)，但在C組中HF組蛋白表達量顯著高于LF組(P<0.05)(圖 4～5)。

2.4 脾臟中3 種蛋白表達量與體重間的相關性分析

CD5蛋白與體重之間呈顯著正相關性(r=0.68,P<0.001)；抗Col- Ⅰ抗體與體重之間呈顯著正相關性(r=0.43,P=0.037)；IL- 10與體重之間的相關性不顯著(r=0.38,P=0.071)。

圖 1 4 組頜骨中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的免疫組化染色結果

圖 2 4 組頜骨中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的蛋白表達水平

圖 3 4 組頜骨中CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10的mRNA表達水平

圖 4 4 組脾臟中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的蛋白印跡 圖 5 4 組脾臟中CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10的蛋白表達水平

3 討 論

本實驗發現P組中CD5與抗Col- Ⅰ抗體的蛋白表達量和相關mRNA水平均顯著高于C組(P<0.001)。這與前期報道類似[8-9]。雖然之前對2 種蛋白進行過研究，但是研究均為獨立的，未曾闡明二者關系。Koutouzis結合B- 1a細胞大量出現在自身免疫患者體內和在牙周病損局部表達顯著升高這一事實，認為牙周炎與類風濕性關節炎等自身免疫疾病之間有著類似的病理機制，推測B- 1a細胞是牙周炎局部天然抗體(抗Col- Ⅰ抗體)的分泌細胞[13]。Sugawara[11]發現牙周袋底部和中部的牙齦結締組織中浸潤大量的B- 1a細胞，同時在相應位點的齦溝液中還發現高濃度的抗Col- Ⅰ抗體。本研究雖未對小鼠的齦溝液進行分析(鑒于提取困難)，但通過免疫組化染色發現牙齦結締組織的中下部，浸潤著表達量近似的B- 1a細胞和抗Col- Ⅰ抗體。在動物模型上的這一發現，使得B- 1a細胞與抗Col- Ⅰ抗體之間的關系更清晰明了。

Aramaki[14]表示B- 1a細胞分泌的膠原抗體在牙周炎癥局部依舊發揮著對抗細菌和其分泌的內毒素的作用。本實驗免疫組化染色中還發現B- 1a細胞除了在牙齦結締組織中浸潤，上皮內也有表達，說明B- 1a細胞阻擋了致病菌初期對牙周組織的破壞，從表達位置的特殊性印證了Aramaki的觀點。從HFC組中的相關蛋白及mRNA表達量均高于LFC組中得出，單純肥胖機體的炎癥狀態在牙周局部有所體現，并促使B- 1a細胞的增殖。但LFP組中的相關蛋白及mRNA表達量均高于HFP組，說明肥胖對牙周局部炎癥產生免疫抑制。Amar[15]曾對此提出免疫耐受理論，認為肥胖環境下的牙周炎癥刺激可致使免疫細胞處于抑制狀態。此理論雖然針對單核/巨噬細胞提出，但B- 1a細胞與其同為固有免疫，所以免疫耐受理論對這一現象解釋更為合理。

本研究對肥胖小鼠脾臟中的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體進行定量檢測后發現3 種蛋白在肥胖機體內均有不同程度的表達，HF組中CD5和IL- 10表達量顯著高于LF組(P<0.05)，并且CD5與抗Col- Ⅰ抗體的表達量隨著小鼠體重的增加而不斷上調。這不僅說明B- 1a細胞參與了脂肪組織引發的免疫炎癥過程，而且在炎癥狀態中發揮了一定的免疫機制。肥胖環境下牙周感染對脾臟中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的表達變化沒有起到顯著性影響。應該是小鼠5天的牙周急性感染相對于人體牙周炎的慢性發病在病理機制上表現的不同所致。

綜上所述，肥胖機體內與牙周炎局部均存在B- 1a細胞并顯著表達，但并未發現這兩種炎癥狀態之間存在顯著性影響，還需對B- 1a細胞在牙周炎與肥胖病理機制中的作用進行深入探索。