GSK- 3β對正畸牙齒移動的影響

孫聰 劉文佳 金巖 金鈁

正畸牙齒移動是一種對機械力的生物學反應。牙齒移動是加力裝置導致牙槽骨改建的結果，應力分別會導致壓力側的骨質吸收和張力側骨質形成。為了使牙齒移動到想要的位置，壓力側的牙槽窩形成間隙以便牙齒移動而張力側會出現進行性的骨形成。骨的改建包括骨的吸收和骨的生成，正常骨組織這一過程是相互平衡的。正畸牙齒移動過程中壓力側破骨細胞活化破骨，牙齒向壓力側移動，張力側形成間隙被新生骨充滿[1]。正畸牙齒移動過程不僅僅和破骨細胞與成骨細胞活動相關，其復雜之處在于各種信號通路、炎癥反應以及細胞因子等變化都參與其中，了解它們之間的相互關系對研究牙齒移動機制具有重要意義。

糖原合酶激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3，GSK- 3β) 是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在蛋白質合成、信號傳遞、細胞增殖、細胞分化、炎癥反應、神經功能、腫瘤形成及胚胎發育等眾多細胞進程中均扮演重要的角色。GSK- 3β能夠使多種底物發生磷酸化，并參與胰島素、Wnt、Rankl以及Hedgehog等多個信號通路的調控，在其中發揮重要作用[2]。許多研究表明GSK- 3β在炎癥反應和骨改建中發揮重要作用[3-4]。因此我們引進GSK- 3β基因敲除小鼠來研究GSK- 3β在正畸牙齒移動過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

正畸用鎳鈦螺旋拉簧(上海埃蒙迪)，正畸測力計(奧杰G212- 01，杭州)，結扎鋼絲(0.1 mm)，自制開口器，酸蝕劑(第四軍醫大學口腔醫院)，3M粘結劑(3M Unitek，美國)，光固化燈(LY- B200，廣東佛山)，器械盒(剪刀，鑷子，針持，手術刀，眼科剪)，牙科氣槍，戊巴比妥鈉(1%)，Micro CT(GE公司，美國)。

1.2 實驗動物與分組

選擇10 周齡，無特定病原體動物(SPF級)，雄性C57小鼠20 只(由第四軍醫大學實驗動物中心提供)，體重20 g左右，動物飼養于完全潔凈環境下(第四軍醫大學組織功能工程中心動物房)。自由進食消毒固體飼料，飲消毒清水，室溫控制下飼養。

實驗分組：GSK- 3β基因敲除組與野生型注射LiCl，各加力3、7 d后處死，5 只/組；野生型組與GSK- 3β基因敲除組：各加力3、5、7、14 d處死，5 只/組。

1.3 基因敲除小鼠繁殖鑒定

1.3.1 基因敲除小鼠繁殖 取1 只雄性GSK- 3β基因敲除C57小鼠和2 只雌性野生型C57小鼠合籠，每天檢查受孕，雌性小鼠出現精栓后分籠。產仔3 周左右進行基因鑒定，雌雄分籠。

1.3.2 基因敲除小鼠基因鑒定 待小鼠滿3 周后，打耳標，取尾約1 mm，分別放入100 μl裂解液+2 μl蛋白酶K中，55 ℃水浴過夜，再調節溫度85 ℃水浴1 h使蛋白失活。進行PCR擴增后凝膠劑電泳，熒光燈下觀察結果(圖 1)，同時含有2 個條帶450 bp和333 bp的樣本2、4、8為基因敲除小鼠，其余樣本只含有1 個條帶333 bp為野生型。

圖 1 小鼠基因鑒定結果

1.4 實驗方法

1%戊巴比妥鈉腹腔注射全身麻醉(注射時頭部朝下，回抽無血注射，防止損傷內臟)，待麻醉徹底后在手術板上固定小鼠四肢，開口器開口，酒精棉球擦洗第一磨牙(M1),氣槍吹干，酸蝕劑酸蝕約40 s，酒精棉球擦洗干凈，氣槍吹干牙面，涂3M底膠，光固化燈照射10 s，拉簧剪4 mm左右一側彎圈，用3M固體膠粘于M1表面，注意清潔膠體不要接觸第二磨牙和牙齦，光固化燈固化40 s。同樣酸蝕切牙吹干，在2 個切牙上制作樹脂球，將另一側拉簧綁在磨牙上，測力計測力，大小控制在30 g。剪斷多余結扎絲，樹脂球包裹切端，防止磨傷黏膜[5](圖 2)。

圖 2 建立小鼠正畸牙齒移動模型

50 只小鼠同樣方法固定拉簧，力值大小控制為30 g，術后喂養松軟食物(如面包)，每天觀察小鼠體征，檢查拉簧固定狀況，拉簧損壞脫落及時同樣方法修復。

1.5 標本采集

野生型組和GSK- 3β組根據分組在3、5、7、14 d；野生型注射LiCl組(隔天100 ng/ml)[6]3、7 d采取脫頸法處死，迅速分離小鼠上頜骨，取右側小鼠牙及牙周組織，迅速放入4%多聚甲醛固定24 h，每組各隨機取3 只掃Micro CT。然后，自來水沖洗24 h，16%EDTA脫鈣，2～3 d換液1 次，脫鈣3 周左右，針刺法檢測脫鈣狀況，脫鈣結束后，30%蔗糖脫水過夜，包埋液包埋，冰凍切片進行免疫熒光染色。

1.6 免疫熒光染色

冰凍切片室溫下晾干30 min，PBS洗5 min×3，2%BSA37 ℃封閉60 min，置切片于濕盒內，滴加一抗(trap)4 ℃過夜，PBS洗5 min×3，滴加二抗37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3，用1 g/ml Hoechst染核20 min，PBS洗5 min×3，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察或-20 ℃避光保存。

2 結 果

2.1 正畸牙齒移動距離

加力3、5、7、14 d(本實驗重在觀察基因敲除小鼠與野生型的差別因此分多組進行觀察)的Micro CT掃描結果顯示：野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠各組內對比，牙齒明顯移動，差異有統計學意義；野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠同期相比，加力后牙齒移動距離有差異，且差異有統計學意義。基因敲除小鼠的牙齒移動距離較野生型的明顯縮短(表 1)。

表 1結果顯示：抑制GSK- 3β可以抑制小鼠正畸牙齒移動，而注射LiCl會產生與敲除GSK- 3β在牙齒移動方面會產生類似的效果。

表 1 野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠牙齒移動距離

注： 野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠各組內對比，P<0.05； 野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠同期各組相比，P<0.05

GSK- 3β基因敲除型與野生型注射LiCl小鼠加力后取材掃描MicroCT結果顯示：正畸加力后牙齒出現明顯移動，統計結果顯示3、7d(查閱相關文獻發現應用3、7 d時間進行研究正畸牙齒移動較多；另一方面只是對比基因敲除與藥物注射的區別無需長時間進行觀察因此只選用2 個時間段)的GSK- 3β基因敲除小鼠與野生型注射LiCl小鼠牙齒移動距離無統計學差異(表 2)。

表 2 GSK- 3β基因敲除小鼠與野生型注射LiCl小鼠牙齒移動距離

Tab 2 Tooth movement distance of the GSK- 3 gene knockout mice and wild type mice injected with LiCl

(n=5， μm)

注： 3 d：P>0.05； 7 d：P>0.05

2.2 加力后破骨細胞變化

免疫熒光(Trap)染色結果顯示：加力3d破骨細胞野生型高于基因敲除型小鼠水平；而加力7 d時破骨細胞野生型也明顯高于基因敲除小鼠水平，差異有統計學意義；而GSK- 3β基因敲除組與野生型注射LiCl組相比無明顯差異。此結果與Micro CT結果相一致(表 3)。

由此可得出結論:GSK- 3β可以通過改變破骨細胞的水平從而影響小鼠正畸牙齒移動。

表 3 破骨細胞數量

注： 野生型組與GSK- 3β基因敲除組相比, 3 d：P<0.05； 7 d：P<0.05； 野生型注射LiCl組與野生型注射LiCl組相比3 d：P>0.05； 7 d：P>0.05

3 討 論

3.1 基因小鼠在正畸研究中的應用

本實驗引進基因敲除小鼠和常規注射抑制劑做對比，發現基因敲除小鼠比常規注射抑制劑效果稍明顯，但是差別不具有統計學意義。雖然不具有顯著區別，但在以后的研究中應用基因小鼠不失為一種更好的選擇，一方面可以從根本上抑制目的基因，目的蛋白，避免藥物其他影響的干擾性；另一方面會使得實驗更加容易操作，避免注射藥物過程中導致的動物受傷，死亡等狀況。談及基因敲除動物，最佳動物是小鼠，但是在正畸牙齒移動模型中往往是應用稍大型動物，因為易于操作，然而也有其弊端，就是很難用大樣本實驗來說明問題。本實驗嘗試應用小鼠作為正畸加力模型，成功制作模型后進行加力，采取較大樣本，各階段觀察的方法，較為有力的證明GSK- 3β影響正畸牙齒的移動。

3.2 GSK- 3β對正畸牙齒移動影響的潛在途徑

研究表明LiCl可以通過Wnt/β- catenin信號通路增強骨的形成。LiCl通過抑制GSK- 3β增強β- catenin信號來治療躁郁癥已幾十年了[7]。GSK- 3β影響牙齒移動可能通過：(1)通過Wnt等通路影響骨質改建從而影響牙齒移動。Wnt影響骨改建已經被證實。而目GSK- 3β對Wnt系統的調節方式，目前認為有如下2 種方式：①GSK- 3磷酸化β- catenin的第33 、37 、41、45位點上的絲氨酸和蘇氨酸。這些位點的磷酸化對于β- catenin的降解具有重要意義。實驗證明，β- catenin N- 端的缺失(缺乏以上這些位點)后在體內表現出持續的穩定，并且不影響其與a- catenin、E- cadherin以及LEF- 1/Tcf的結合。在多種腫瘤中的確發現類似的突變。②GSK- 3對β- catenin的另一個調節機制是通過對APC的調節β- catenin產生影響。GSK- 3可以經axin直接磷酸化APC。磷酸化的APC會增加其與β- catenin的結合，繼而降解β- catenin。β- catenin在N- 端有一個序列，該序列是APC等的結合域。但是實驗證明，缺乏APC結合區的β- catenin仍然會被APC誘導降解，這就提示我們，APC誘導β- catenin降解的作用不僅可以通過直接與β- catenin結合產生，而且可以通過其它 間接途徑產生。目前推測這種間接途徑是經conductin/axin對β- catenin產生影響[8]。(2)通過NF- κB等通路影響炎癥反應的過程從而影響正畸過程中的破骨啟動。目前對于GSK- 3β在該系統中的具體調節機制并不清楚，但實驗證實，在NF- κB系統中，如果出現GSK- 3β的缺失，將會出現細胞對TNF誘導的細胞凋亡非常敏感[9]。而TNF是正畸牙齒移動過程中非常重要的細胞因子。(3)影響巨噬細胞的極化來影響牙齒移動。周彥恒等[10]發現當在正畸牙齒移動過程中注射巨噬細胞抑制劑時，牙齒移動距離和破骨細胞量明顯減少；而當在正畸牙齒移動過程中注射M1型巨噬細胞時牙齒移動近距離明顯增加。而且GSK- 3β是巨噬細胞極化過程中的重要調節因子[11]。(4)通過影響神經效應進而改變過改建。周彥恒等[12]發現神經系統可以影響正畸牙齒移動過程，而且GSK- 3β在神經發育方面也有重要作用[3]。

3.3 展望

正畸牙齒移動的主要影響因素還未明確，如今研究重點大多放在各種藥物如何影響破骨上，而巨噬細胞被認為是破骨細胞的前體細胞，而且周彥恒等的最新研究發現巨噬細胞的極化可以影響正畸牙齒移動過程中的破骨和牙根吸收，這正好和GSK- 3β的效果相符，而且GSK- 3β是巨噬細胞極化過程中的重要調節因子，丁寅等研究也發現在正畸大鼠牙齒移動過程中iNOS發生顯著變化[13]，而iNOS是巨噬細胞極化的相關因子，因此下一步研究可以重點放在GSK- 3β是否影響巨噬細胞極化上，這不僅有利于對正畸過程的進一步研究，而且對于巨噬細胞的研究也有重要意義。