基因編輯技術簡介

陳兆亮+康珍

摘 要 基因編輯技術是對基因組進行精確定點改造的一項新技術，同時也是研究基因生物功能的一個有力工具。經過數年的發展，目前主要有鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應物核酸酶和RNA引導的CRISPR/Cas核酸酶技術三種新型的基因編輯技術。綜述了三種技術的結構原理和作用機理，并對基因編輯技術進行了展望。

關鍵詞 基因編輯 鋅指核酸酶 轉錄激活因子樣效應物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶

中圖分類號 Q-49 文獻標志碼 E

基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項新技術。利用該技術，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達成了“編輯基因”。

1 研究背景

近年來，隨著分子生物學的迅速發展，研究人員正通過定點突變的方法使目的基因完全失活來研究特定基因的功能，這是一種最直接有效的研究方法。隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現和技術體系的完善，基因編輯技術獲得了飛速發展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點基因敲除、敲入變得更為簡單且高效。與傳統的以同源重組和胚胎干細胞（ES）技術為基礎的基因打靶技術相比，基因編輯新技術保留了可定點修飾的特點，并應用到更多的物種上，效率更高，構建時間更短，成本更低。

2 基因編輯原理

現代基因編輯技術的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂（DSB）激活細胞的天然修復機制，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復（HDR）兩條途徑。

2.1 非同源末端連接

非同源末端連接是一種低保真度的修復過程，斷裂的DNA修復重連的過程中會發生堿基隨機地插入或丟失，造成移碼突變，使基因失活，實現目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ機制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點，從而實現定點的基因敲入。

2.2 同源重組修復

同源重組修復是一種相對高保真度的修復過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整地整合到靶位點，不會出現隨機的堿基插入或丟失。若在一個基因兩側同時存在DSB及同源供體的情況下，可以進行原基因的替換。

3 基因編輯技術的種類

目前主要有3種基因編輯技術，分別為人工核酸酶介導的鋅指核酸酶（ZFN）技術；轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）技術；RNA引導的CRISPR/Cas核酸酶技術（CRISPR/Cas RGNs）。

3.1 ZFN基因組編輯技術

ZFN技術是第一代基因編輯技術，是基于鋅指蛋白發展起來的。1986年，Diakun等首先在真核生物轉錄因子的DNA結合區域發現了Cys2/His2鋅指模塊。1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內切酶。2005年，Urnov等發現一對由4個鋅指連接而成的ZFN，可識別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因編輯中的應用。

ZFN由鋅指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸內切酶組成。其中，由ZFP構成的DNA識別域能識別DNA特異位點并與之結合，而由FokⅠ構成的切割域能執行剪切功能，兩者結合可使靶位點的雙鏈DNA斷裂。于是，細胞可以通過同源重組修復機制和非同源末端連接修復機制來修復DNA。HDR修復有可能會對靶位點進行恢復修飾或者插入修飾，而NHEJ修復極易發生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，由此達到基因敲除的目的。

ZFN誘導的基因編輯技術可應用于很多物種及基因位點的編譯，具有較好的發展潛力。但是目前有3個缺陷制約了該技術的推廣：① 以現有的策略設計高親和性的ZFN，需投入大量的工作和時間；② 在細胞中持續表達ZFN對細胞有毒性；③ 雖然三聯體設計具有一定特異性，但仍存在不同程度的脫靶效應。

3.2 TALEN基因組編輯技術

2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌中發現一種轉錄激活子樣因子效應物，是特異識別DNA序列的基礎。TALEN識別模塊一般由34個氨基酸組成，其中第12、13位氨基酸高度可變，被稱為重復可變的雙氨基酸殘基（RVD）。RVD決定了對特異性核苷酸的識別，其與A、G、C、T有恒定的對應關系，如即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G。隨后，TALEN特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術中的鋅指蛋白。它的可設計性更強，不受上下游序列的影響，具備比ZFN更廣闊的應用潛力。

TALEN包含2個TALEN蛋白，每個TALEN都是由TALE array與FokⅠ融合而成。在進行基因編輯時，其中一個TALEN靶向正義鏈上的靶位點，另一個則靶向反義鏈上的靶位點。然后FokⅠ形成二聚體，在靶向序列中間的spacer處切割DNA，造成雙鏈DNA斷裂，隨后細胞啟動DNA損傷修復機制，FokⅠ針對不同的TALEN骨架，其最適宜的spacer長度不同，其長度范圍一般為12～20 bp。實驗結果表明，TALEN在靶向DNA時，第一個堿基為T時其結合效果更佳。

目前，TALEN已經成功應用于酵母、哺乳動物和植物的特異性位點來進行基因打靶，與鋅指核酸酶系統相比有較大的應用優勢，但仍然有些問題需要解決，例如脫靶效應、TALEN與基因組進行特異結合受鄰近序列影響等。

3.3 CRISPR/Cas9基因組編輯技術

CRISPR/Cas9基因編輯技術是最近生命科學領域的一個熱點話題，該項技術的興起使基因編輯領域得到飛躍發展。CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術源于對細菌與古生菌的研究。早在1987年，日本的研究人員發現E.coli中存在一些29 bp的重復序列，但他們當時并不清楚這些序列的具體功能，經過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復序列與細菌的獲得性免疫有關。

2002年，Jansen等將這些間隔排列的重復序列命名為CRISPR，并且鑒定出了與CRISPR序列位于同一基因簇的CRISPR相關蛋白Cas，同時將CRISPR基因簇分為三個不同的類型（Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型），在三種不同類型的CRISPR系統中，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統最為簡單。

CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導的DNA核酸內切酶，由Cas9核酸內切酶與sgRNA構成。轉錄的sgRNA折疊成特定的三維結構后與Cas9蛋白形成復合體，指導Cas9核酸內切酶識別特定靶位點，在間隔序列毗鄰區（PAM）序列上游切割DNA，造成雙鏈DNA斷裂，并啟動DNA損傷修復機制。

經研究，從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統，其CrRNA（或者是人工構建的sgRNA）靶向序列的長度不同，PAM序列也可能不同。

4 基因編輯技術的展望

隨著越來越多物種基因組測序的完成，基因功能的研究成為后基因時代的重點。基因編輯技術既可以用正常基因替代突變基因進行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正常基因進行基因功能的研究。與傳統的基因打靶技術相比，基因編輯技術擺脫了對ES細胞的限制，可以應用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時間更短，得到的突變可以通過種系遺傳。其中，CRISPR系統可以同時進行多靶點的切割，易于得到純合子突變體。

伴隨基因編輯技術的發展，與之相關的多基因連接策略，表達調控策略等配套技術體系正在形成，為今后大規模，多基因動物的改良奠定了基礎。更多基因組編輯畜禽的出現會給畜牧業經濟，人類營養水平和生活質量帶來革命性地影響。可以預見，以基因編輯技術為核心的現代生物技術產業將進入黃金時期。

總之，基因編輯技術的研發還處于起步階段，但其已表現出的相對于基因打靶技術的優勢已十分明顯。在未來的發展中，基因編輯技術必將成為生命科學和生物醫學等領域研究與應用的重要工具。

參考文獻：

[1] Miller J C， Holmes M C， Wang J， et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing[J]. Nature biotechnology， 2007，25（7）： 778-785.

[2] Beerli R R， Barbas C F.Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors[J]. Nature biotechnology， 2002，20（2）： 135-141.

[3] Miller J C， Tan S， Qiao G， et al.A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J].Nature biotechnology，2011， 29（2）： 143-148.

[4] Streubel J， Blücher C， Landgraf A， et al.TAL effector RVD specificities and efficiencies[J]. Nature biotechnology，2012，30（7）： 593-595.

[5] Cermak T， Doyle E L， Christian M， et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J].Nucleic acids research，2011.

[6] Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al.Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J]. Journal of bacteriology，1987，169（12）： 5429-5433.