異丹葉大黃素在Caco—2細(xì)胞模型上轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究

袁紫朔+張婷婷+金波+李彤+馬辰

[摘要]異丹葉大黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理活性。該文研究了異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型上的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。采用UPLC法，應(yīng)用PDA檢測(cè)器在310 nm處對(duì)異丹葉大黃素進(jìn)行含量測(cè)定并計(jì)算表觀滲透系數(shù)P_app。考察不同濃度異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞上的毒性以確定轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。探討了時(shí)間、濃度、溫度、轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對(duì)異丹葉大黃素在體外細(xì)胞模型上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異丹葉大黃素在10～60 μmol·L^-1，孵育14 h內(nèi)，對(duì)Caco-2細(xì)胞沒有明顯毒性。異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)具有一定的濃度依賴性，其表觀滲透系數(shù)P_app大于10×10-6 cm·s^-1，易被Caco-2細(xì)胞吸收。 BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量在3 h達(dá)到最大值，6 h有所下降。4 ℃條件下，P_app（AP-BL）與P_app（BL-AP） 均比37 ℃條件顯著減小。加入P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑維拉帕米后P_app（AP-BL）明顯增大；加入MRP轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑丙磺舒和MK-571后，P_app（BL-AP）明顯減小。研究結(jié)果提示，異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要是被動(dòng)擴(kuò)散，P-gp及MRP可能參與了異丹葉大黃素的外排轉(zhuǎn)運(yùn)。

[關(guān)鍵詞]Caco-2細(xì)胞單層膜模型； 異丹葉大黃素； 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

[Abstract]Isorhapontigenin （ISO） is suggested to have many different kinds of pharmacology activities， such as anti-inflammatory effect， anti-oxidation effect and anti-cancer effect. This paper mainly discussed the transport mechanism of ISO in Caco-2 cell models. The concentration of ISO was determined by UPLC method with PDA detector at 310 nm， and then the apparent permeability coefficient P_app was calculated. The cytotoxic of different concentrations of ISO was investigated on Caco-2 cells to determine the concentration of drug administration. The effects of ISO concentration， time， temperature and transporter inhibitors on the transport of ISO were investigated. The test results showed that， ISO didn′t have significant cytotoxicity at 10-60 μmol·L^-1 in 14 hours. The transportation of ISO on Caco-2 cells was related to the concentration to a certain extent. P_app of ISO was higher than 10×10-6 cm·s^-1 and ISO was absorbed easily by Caco-2 cells. The transport volume of ISO at BL side reached maximum at 3 h and was slightly decreased at 6 h. P_app （AP-BL） and P_app（BL-AP） at 4 ℃ were lower than those at 37 ℃. P_app （AP-BL） of ISO was significantly increased after adding P-gp inhibitor verapamil and P_app （BL-AP） of ISO was significantly decreased after adding MRP-2 inhibitor （probenecid or MK-571）. The results suggested that transport mode of ISO was mainly passive diffusion in Caco-2 cell models， and P-gp and MRP may be involved in the transport of ISO.

[Key words]Caco-2 cell monolayer model； isorhapontigenin； transport mechanism

異丹葉大黃素（isorhapontigenin，ISO）存在于買麻藤類植物中，具有良好的抗炎^[1-2]，抗氧化^[3-5]，治療胰島素抵抗及肥胖^[6]等活性。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)其有顯著的抗膀胱癌活性^[7-11]。有研究表明，小鼠灌胃不同濃度的異丹葉大黃素，采用LC-MS/MS測(cè)定其不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，發(fā)現(xiàn)異丹葉大黃素在小鼠體內(nèi)迅速達(dá)峰，消除迅速，代謝較快^[9]。Caco-2細(xì)胞來源于人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)分化后可形成與人體小腸上皮細(xì)胞一致的形態(tài)及功能，含有廣泛存在于人體小腸上皮細(xì)胞的藥物代謝酶及各種轉(zhuǎn)運(yùn)體^[12]，可以用來研究藥物在體外吸收和代謝情況。該模型是目前應(yīng)用最廣泛，最經(jīng)典的用于研究藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性的體外模型。

本文應(yīng)用Caco-2細(xì)胞模型對(duì)異丹葉大黃素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究，探討藥物濃度、時(shí)間、溫度及轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，為其后續(xù)開發(fā)提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters H-Class超高效液相色譜儀，Empower 3色譜管理站；Transwell（0.4 μm，PET膜， 美國Millipore公司）；細(xì)胞電阻儀（ERS-2，美國Millipore公司）；酶標(biāo)儀（Synergy H1，美國BIOTEK公司）。

異丹葉大黃素購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；維拉帕米（消旋體），MK-571，丙磺舒，硫酸酯酶（Type H-2）均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，雙抗，胰蛋白酶（0.05%，0.02% EDTA），MTT（噻唑藍(lán)）均購自美國Gibco公司；其他化學(xué)試劑均為色譜純。

Caco-2細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均在20～40代。

1.2 色譜條件

Waters BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，10%B，2～2.5 min，10%～35% B，2.5～6 min，35% B，6～6.5 min，35%～10% B，6.5～8 min，10% B，流速0.3 mL·min^-1；樣品室的溫度4 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測(cè)波長310 nm。

1.3 樣品處理

所有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)所得樣品溶液均先加入1倍體積的甲醇，然后置于4 ℃，15 000 r·min^-1離心15 min，取上清液進(jìn)行異丹葉大黃素含量測(cè)定。

1.4 Caco-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.4.1 DMSO細(xì)胞毒性 待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)接種96孔板，接種密度為1×105個(gè)/mL，接種48 h后在培養(yǎng)液中加入DMSO，終濃度分別為 0.1%，0.3%，0.5%，1%，2%，3%，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，隨行空白組，孵育24 h后加入MTT溶液（0.5 g·L^-1），孵育4 h后每孔加入200 μL DMSO，充分溶解紫色結(jié)晶后，于570 nm波長處測(cè)量吸光度A，各組所得A分別與空白組A進(jìn)行t檢驗(yàn)，與空白組對(duì)比無顯著性差異的濃度為安全濃度。

1.4.2 異丹葉大黃素細(xì)胞毒性 待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)接種96孔板，接種密度為1×105個(gè)/mL，接種48 h后在培養(yǎng)液中加入異丹葉大黃素，終濃度分別為10，20，30，40，50，60 μmol·L^-1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，隨行空白組，孵育14 h后加入MTT溶液（0.5 g·L^-1），孵育4 h后每孔加入200 μL DMSO，充分溶解紫色結(jié)晶后，于570 nm波長處測(cè)量A，各組所得A分別與空白組A進(jìn)行t檢驗(yàn)，與空白組對(duì)比無顯著性差異的濃度視為在14 h內(nèi)對(duì)Caco-2細(xì)胞無毒。

1.5 Caco-2細(xì)胞單層膜模型的建立

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，含5%CO₂的環(huán)境中，采用α-MEM培養(yǎng)液，其中添加10%的標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清和1%的雙抗。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底后，用0.05%的胰酶（含有0.02%的EDTA）消化，按1∶3傳代繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板。采用PET膜的12孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板，按上述消化方法接種Caco-2細(xì)胞，接種密度為2×105個(gè)/cm²。細(xì)胞絨毛面（Apical， AP側(cè)）加入400 μL培養(yǎng)液，細(xì)胞基底面（Basolateral， BL側(cè)）加入1 950 μL培養(yǎng)液。前14 d隔天換液，隨后7 d每天換液，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化21 d培養(yǎng)后，應(yīng)用電鏡及陽性質(zhì)控藥對(duì)單層膜模型形態(tài)學(xué)，膜完整性及轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行驗(yàn)證，并在實(shí)驗(yàn)前用細(xì)胞電阻儀測(cè)量跨膜上皮細(xì)胞電阻（transepithelial electrical resistance， TEER），大于500 Ω×cm²的細(xì)胞單層膜可用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)前用Hank′s緩沖鹽溶液（Hank′s balanced salt solution， HBSS，pH=7.4，含有5 mmol·L^-1HEPES）清洗細(xì)胞單層膜3次。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)之后，需再次用細(xì)胞電阻儀測(cè)量TEER，TEER大于500 Ω×cm²的孔為實(shí)驗(yàn)有效孔，數(shù)據(jù)可用，TEER小于500 Ω×cm²孔所得數(shù)據(jù)不可用。

1.6 異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

1.6.1 異丹葉大黃素溶液的制備 精密稱取異丹葉大黃素適量，用DMSO溶解為20 mmol·L^-1的母液；4 ℃冷藏儲(chǔ)存。應(yīng)用時(shí)用HBSS稀釋至目標(biāo)濃度，過濾除菌（DMSO總含量不超過0.5%）。

1.6.2 數(shù)據(jù)處理 采用表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，P_app）和滲透方向率（PDR）表示。

ΔQ為Δt內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量，A為膜面積（1.12 cm²），C₀為初始給藥濃度。

由于每次取樣后需補(bǔ)加HBSS緩沖液，稀釋了藥物濃度，因此藥物的累積吸收濃度使用校正公式。

Ccum表示藥物累積濃度，A_N表示第n 個(gè)樣品通透濃度，V_N表示第n 個(gè)樣品的采樣體積，V 表示接受池的體積。

PDR=P_app（BL-AP）/P_app（AP-BL）

P_app（BL-AP）為藥物從BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到AP側(cè)的表觀滲透系數(shù)，P_app（AP-BL）為AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到BL側(cè)的表觀滲透系數(shù)。

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

每組數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)平均值，用±s表示。

1.6.3 時(shí)間及濃度對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 根據(jù)1.4.2異丹葉大黃素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別取濃度為10，20，30，40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液各400 μL，加入AP側(cè)，作為供給池，取HBSS緩沖液1 950 μL加入BL側(cè)，作為接收池，置于轉(zhuǎn)速為35 r·min^-1的37 ℃恒溫?fù)u床中，分別于1，3，6 h從BL側(cè)取出200 μL樣品溶液，同時(shí)補(bǔ)加200 μL空白HBSS。樣品溶液經(jīng)處理后測(cè)定異丹葉大黃素的含量，并計(jì)算P_app。

1.6.4 溫度對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 取濃度為40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液400 μL，加入AP側(cè)，作為供給池，取HBSS緩沖液1 950 μL加入BL側(cè)，作為接收池，平行2份，一份放置于37 ℃恒溫?fù)u床中，一份放置于4 ℃冰箱中，均孵育1 h。從接收池取200 μL樣品溶液，樣品溶液經(jīng)處理后測(cè)定異丹葉大黃素的含量，并計(jì)算P_app及PDR。

1.6.5 轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 分別從AP-BL，BL-AP 2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)方向考察異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，同時(shí)考察轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑維拉帕米、丙磺舒、MK-571對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

異丹葉大黃素組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液）；異丹葉大黃素+維拉帕米組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液配制含有200 μmol·L^-1維拉帕米的溶液）；異丹葉大黃素+丙磺舒組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液配制含有200 μmol·L^-1丙磺舒的溶液）；異丹葉大黃素+MK-571組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液配制含有100 μmol·L^-1的MK-571溶液）。

AP-BL方向：AP側(cè)加入各組溶液400 μL作為供給池，BL側(cè)加入1 950 μL的空白HBSS緩沖液作為接收池，置于37 ℃，35 r·min^-1的恒溫?fù)u床中孵育1 h。從接收池取200 μL樣品溶液，樣品溶液經(jīng)處理后測(cè)定異丹葉大黃素的含量，并計(jì)算P_app。

BL-AP方向：BL側(cè)加入各組溶液1 950 μL作為供給池，AP側(cè)加入400 μL空白HBSS緩沖液作為接收池，置于37 ℃，35 r·min^-1的恒溫?fù)u床中孵育1 h。從接收池取200 μL樣品溶液，樣品溶液經(jīng)處理后測(cè)定異丹葉大黃素的含量，并計(jì)算P_app。

2 結(jié)果

2.1 UPLC含量測(cè)定方法學(xué)考察

將異丹葉大黃素用HBSS稀釋至0.2，1，5，10，50，100 μmol·L^-1，按照1.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)Y，異丹葉大黃素濃度為橫坐標(biāo)X，得到異丹葉大黃素的線性回歸方程為Y=43 649X+6 699.3，r=0.999 1，線性范圍0.2～100 μmol·L^-1。選擇低、中、高（5，10，40 μmol·L^-1）濃度的異丹葉大黃素溶液按照1.3項(xiàng)所示的樣品處理方法處理，分析并計(jì)算。結(jié)果表明，低、中、高濃度下樣品測(cè)定的回收率分別為90.92%，96.12%，98.03%；精密度分別為3.0%，1.7%，1.1%。考察5 μmol·L^-1異丹葉大黃素在不同溫度的穩(wěn)定性，4 ℃ 4 h，RSD為0.46%，37 ℃ 7 h，RSD為7.8%，溶液穩(wěn)定。空白溶劑色譜圖及異丹葉大黃素專屬性色譜圖（tR = 4.9 min）分別見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所建立方法符合生物樣品的定量要求。

2.2 Caco-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 DMSO細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 當(dāng)DMSO濃度大于0.5%時(shí)，開始對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，濃度越大毒性越大。因此，實(shí)驗(yàn)所用的化合物溶液中DMSO濃度應(yīng)小于0.5%，結(jié)果見圖2。

2.2.2 異丹葉大黃素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 當(dāng)孵育時(shí)間為14 h，異丹葉大黃素濃度在10～60 μmol·L^-1時(shí)，其對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)所選取的孵育時(shí)間及給藥濃度應(yīng)參照此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見圖3。

2.3 時(shí)間及濃度對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

隨著時(shí)間增加，透過Caco-2細(xì)胞單層膜的異丹葉大黃素的量逐漸增加，并在3 h達(dá)到最大值，在6 h有所下降，見圖4。在1 h轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，異丹葉大黃素的P_app隨著濃度增加而增加，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，且P_app均大于10×10-6 cm·s^-1，屬于高滲化合物，見表1。

2.4 溫度對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

蛋白在低溫條件下活性減弱，因此Caco-2細(xì)胞膜上存在的各種轉(zhuǎn)運(yùn)體在低溫條件下其功能會(huì)有所降低。4 ℃條件下所測(cè)得P_app（AP-BL）和P_app（BL-AP）均顯著小于37 ℃所測(cè)得的值，見表2。除此之外，37 ℃條件轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果計(jì)算的PDR為1.3，需用轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑來確定異丹葉大黃素是否為外排轉(zhuǎn)運(yùn)的底物。

2.5 轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

常見外排轉(zhuǎn)運(yùn)體有P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥蛋白（MRP）等，分別加入P-gp抑制劑維拉帕米及MRP抑制劑丙磺舒和MK-571后，所測(cè)得的異丹葉大黃素的PDR均減小。加入維拉帕米后，異丹葉大黃素AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向的P_app明顯增大，見表3；加入丙磺舒和MK-571后，異丹葉大黃素AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向的P_app增大，BL-AP轉(zhuǎn)運(yùn)方向的P_app明顯減小，分別見表4，5。

3 討論

應(yīng)用Caco-2細(xì)胞單層膜模型對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究，能夠在體外細(xì)胞水平提供其通過小腸上皮細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的信息，用以推測(cè)其在人體腸道中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特性。

異丹葉大黃素的P_app大于10×10-6 cm·s^-1，屬于高滲化合物。其吸收迅速，有濃度依賴性，P_app隨著給藥濃度增加而增大，表明異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型中以被動(dòng)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)為主。

當(dāng)溫度降低到4 ℃時(shí)， AP-BL方向和BL-AP方向的跨膜過程都受到了明顯抑制，P_app均明顯下降。在4 ℃時(shí)，需要能量的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程基本被抑制，結(jié)果提示異丹葉大黃素的跨膜過程有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的存在。

P-gp，MRP是Caco-2細(xì)胞中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其能發(fā)揮外排泵作用，將細(xì)胞內(nèi)的化合物逆濃度梯度運(yùn)至細(xì)胞外，其結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致藥物透膜吸收減少，生物利用度降低。加入P-gp和MRP抑制劑后，明顯降低其轉(zhuǎn)運(yùn)的方向性。加入P-gp抑制劑維拉帕米后，異丹葉大黃素AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向的P_app明顯增大，提示異丹葉大黃素可能為P-gp蛋白的底物。加入MRP抑制劑丙磺舒和MK-571后，異丹葉大黃素AP-BL方向的P_app有所增加，BL-AP轉(zhuǎn)運(yùn)方向的P_app明顯減小，提示異丹葉大黃素可能為MRP的底物。P-gp和MRP可能參與了異丹葉大黃素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型上吸收具有時(shí)間依賴性，BL側(cè)異丹葉大黃素的量在3 h達(dá)到最大值，隨后有所下降。此現(xiàn)象與白藜蘆醇在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)特征類似^[14]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道^[9]，小鼠灌胃異丹葉大黃素單體所得到的tmax為（0.14±0.05） h，t1/2為（1.72±0.27） h，MRT為0.70±0.20，提示異丹葉大黃素在體內(nèi)吸收迅速且代謝廣泛，推測(cè)BL側(cè)異丹葉大黃素下降可能與其代謝迅速并被外排有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究了異丹葉大黃素在 Caco-2 細(xì)胞上的吸收特征，包括時(shí)間、濃度、溫度及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)異丹葉大黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 結(jié)果表明，異丹葉大黃素在Caco-2細(xì)胞模型上吸收迅速，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以濃度依賴性的被動(dòng)擴(kuò)散過程作用為主，同時(shí)P-gp，MRP等外排轉(zhuǎn)運(yùn)體參與其轉(zhuǎn)運(yùn)過程。推測(cè)異丹葉大黃素在人體腸道中可被迅速完全吸收，但因P-gp，MRP的外排作用，可能影響其口服生物利用度，限制其藥理活性及應(yīng)用。

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[責(zé)任編輯 曹陽陽]