阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織可塑性變化及其對谷氨酸受體與相關蛋白的影響

魏春杰 王增冕 李桂蘭 盛寶英 齊志國

(佳木斯大學附屬第一醫院神經三科，黑龍江 佳木斯 154002)

阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織可塑性變化及其對谷氨酸受體與相關蛋白的影響

魏春杰 王增冕 李桂蘭 盛寶英 齊志國

(佳木斯大學附屬第一醫院神經三科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 探討阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬組織可塑性的變化及對谷氨酸受體與相關蛋白的影響。方法 50只健康雄性SD大鼠隨機分為AD模型組和對照組，每組25只。AD模型組雙側海馬注射Aβ1～42，利用水迷宮實驗進行入組鼠篩選，建立AD大鼠模型，在基線記錄維持40 min后給予能誘發長時程增強(LTP)的高頻刺激，記錄f EPSP，采用經典的蔗糖密度梯度離心來提取突觸小體、支架蛋白和CaMKIIα，分析AD模型大鼠海馬組織可塑性變化及對谷氨酸受體與相關蛋白的影響。結果 高頻刺激能誘導LTP持續數小時之久。實驗中通過刺激海馬區側支旁通路，在CA1區輻射層記錄興奮性突出后場電位，結果顯示：海馬區組織可塑性變化產生LTP并不依賴于NRB2活性；AD模型組海馬區內谷氨酸受體及相關蛋白水平含量顯著高于對照組(P<0.05)。結論 采用水迷宮實驗能成功建立大鼠AD模型，且海馬組織可塑性變化對谷氨酸受體與相關蛋白能產生明顯的影響，海馬學習記憶機制參與成癮和戒斷引起的行為適應性變化。

阿爾茨海默病(AD)；大鼠海馬組織；谷氨酸受體

阿爾茨海默病(AD)屬于是一種多因素疾病，涉及多種病理機制，并形成神經細胞凋亡理論。長時程增強(LTP)是一種簡單的高頻刺激興奮性輸入端引起的突出強度的持續增加，能反映突出可塑性變化中的神經電生理活動的改變〔1〕。本文擬探討AD模型大鼠海馬組織可塑性的變化及對谷氨酸受體與相關蛋白的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年5月至2016年5月健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質量102～200 g，平均(153±15)g，周齡6～10 w，動物由醫院動物實驗室提供，實驗過程中對SD大鼠飼養、處理均符合《關于善待實驗動物的指導下意見》〔2〕相關規則，許可證號：SCXK 2007-0010。本次臨床診斷試驗均經醫院倫理會批準，大鼠一般資料無統計學差異。將大鼠隨機分為AD模型組和對照組，每組25只。

1.2 AD模型鼠的制備 選擇雙側海馬CA1區作為注射靶點，一次性注射凝聚態Aβ1～42制備AD模型。大鼠腹腔注射濃度為10%水合氯醛(3.5 ml/kg)溶液進行局部麻醉，將大鼠固定在立體定位儀上。采用牙科鉆鉆開顱骨，利用微量注射器自硬腦膜垂直進針2.8 mm，緩慢注射10 min，留針5 min，每側注射5 μl，利用水迷宮實驗進行入組鼠篩選。利用定位航行實驗測量大鼠對水迷宮的學習記憶能力〔3〕。第1天讓大鼠自由游泳，上、下午各1次；第2天進行Morris水迷宮測試，將大鼠放置在水迷宮中固定象限，距離池壁20 cm，測試前在大鼠頭部涂抹苦味酸標記，并向水池中加入適量的二氧化鈦粉，保持安靜，室內以恒定日光燈照射，保持水迷宮實驗幾天位置、環境不變，將大鼠放入池壁水中，1次/d，每次測試120 s，連續測試5 d，對于測試大鼠在120 s內找到平臺，則讓其停留在平臺上15 s完成測試〔4〕。

1.3 LTP記錄和LTP誘導 在基線記錄維持40 min后采用能誘發LTP的高頻刺激：將10個連續的、間隔時間為25的刺激串，每個刺激串包含20個200 Hz的脈沖。記錄神經元白發快興奮性突觸后電位(fEPSP)。

1.4 海馬組織的勻漿、突觸小體的提取和總蛋白濃度測定 采用經典的蔗糖密度梯度離心來提取突觸小體。梯度離心主要是指等分離的物質在具備密度階梯的介質中完成，依靠不同物質不同的密度完成分離。采用蔗糖作為介質，在離心管內形成一個不連續的密度梯度，從上到下依次為0.8 mol/L和1.2 mol/L，將粗提到的組織樣本置于蔗糖梯度的頂部〔5〕。在梯度介質中，當被分離的物質分別達到與其密度相同的介質部位時就不再移動，達到分離的目的〔6〕。

1.5 統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1 海馬CA1區N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的LTP不依賴于小鼠單克隆抗體(NR2B)的活性 高頻刺激能誘導LTP持續數小時之久。實驗中通過刺激海馬區側支旁通路，在CA1區輻射層記錄興奮性突出后場電位，結果顯示海馬區組織可塑性變化產生LTP并不依賴于NRB2活性，提示大鼠體內長期的海馬組織可塑性變化會伴有相關蛋白的表達改變。見圖1。

a、b圖為基線記錄40 min后電刺激興奮性場電位變化；c圖為0.033 Hz測試刺激下的基線40～180 min 圖1 海馬CA1區NMDA受體介導的LTP不依賴于NR2B的活性

2.2 兩組大鼠海馬區內谷氨酸受體及相關蛋白比較 AD模型組海馬區內谷氨酸受體〔(7.4±0.3)μmol/g〕及相關蛋白CaMK Ⅱα含量(5.31±0.85)顯著高于對照組〔(2.1±0.1)μmol/g、1.02±0.23〕(P<0.05)。

3 討 論

細胞凋亡途徑主要有線粒體途徑和非線粒體途徑〔7〕。在線粒體途徑中，細胞內的死亡細胞(如DNA、毒素和ATP耗竭等)均容易引起線粒體釋放細胞色素C進入細胞質。而在非線粒體途徑中，死亡信號主要依賴于死亡配體和受體的相互結合，從而誘導死亡受體的死亡結構及相關信號分子的轉導〔8〕。

腦變化涉及內容相對較多，遍及生命，包括記憶、熟練、情緒及精神疾病和藥物的成癮。這些變化在大腦中是長期的、永久的，部分行為甚至對人能產生較遠的影響，臨床上將向大腦這樣長期的變化稱之為神經可塑性。大腦是一個巨大的網絡，該網絡由1 101神經元組成，承受104輸入并發出接近104的信息的輸出。而神經元之間的接觸或突出的變化更加接近1 015。因此，突觸數目的變化及突出效能的變化均會引起神經元可塑性的變化。而LTP是由一種簡單的高頻刺激興奮性輸入端引起突出強度的持續增強〔9〕。谷氨酸受體在人體海馬區中發揮了重要的作用，它屬于神經遞質受體，興奮性突出的谷氨酸能與NMDA受體、AMP A受體相互接觸。而在突觸上，NMDA受體能與多種蛋白復合物形式相互作用，包括神經遞質受體、細胞薪附蛋白、細胞骨架蛋白、支架蛋白、信號分子等，NMDA受體能與多種信號通路形成一種復合物共存的NMDA，并且在突觸可塑性、學習記憶中發揮了重要的作用。受體在突觸上的數目、種類、組成、與不同蛋白間的相互作用以及下游的信號傳導通路的改變都組成了神經化學物質活動的改變，從而參與了突觸可塑性的改變。本研究臨床上對于AD的發病機制、治療方法及藥物的選擇等均需要進一步研究和探討。

本研究采用水迷宮實驗能成功建立大鼠AD模型，且海馬組織可塑性變化對谷氨酸受體與相關蛋白能產生明顯的影響，海馬學習記憶機制參與成癮和戒斷引起的行為適應性變化。

1 吳紅彥，李海龍，張 云，等.黑逍遙散對東莨菪堿致癡呆小鼠模型的影響〔J〕. 中國中醫藥信息雜志，2013；20(10)：35-7.

2 Wu J，Bie B，Yang H，etal.Activation of the CB2 receptor system reverses amyloid-induced memory deficiency〔J〕.Neurobiol Aging,2013;34(3)：791-804.

3 亓 珅，杜怡峰.炎性反應在阿爾茨海默病發病機制中作用的研究進展〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志，2013；20(4)：278-80.

4 宋春未，戴雪伶，姜招峰.阿爾茨海默病實驗動物模型研究進展〔J〕.生物學雜志，2013；30(5)：85-8.

5 徐 琴，竺智偉，趙正言.Drebrins 和 Icam-5 在 Fmr-1 基因敲除鼠大腦皮層的表達和意義〔J〕.中華神經醫學雜志，2012；11(7)：658-62.

6 陳奕晨，徐紅波，胡子成，等.首發未用藥抑都癥患者血漿氨基酸檢測分析及其臨床意義〔J〕.第三軍醫大學學報，2012；34 (14)：1442-5.

7 Sarabdjitsingh RA，Kofink D，Karst H，etal.Stress-induced enhancement of mouse amygdalar synaptic plasticity depends on glucocorticoid and beta-adrenergic activity〔J〕.PLoS One，2012；7(8)：e42143.

8 Zhou M，Hoogenraad CC，Joels M，etal.Combined beta-adrenergic and corticosteroid receptor activation regulates AMPA receptor function in hippocampal neurons〔J〕.J Psychopharmacol，2012；26(4)：516-24.

9 吳定國，李偉華，周志鴻，等.銀杏酮酯滴丸在阿爾茨海默病治療中的應用〔J〕.中國醫院藥學雜志，2013；33(9)：712-5.

〔2016-10-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

黑龍江省教育廳課題(12531699)

齊志國(1972-)，男，主任醫師，碩士，主要從事神病學相關臨床和基礎研究。

魏春杰(1980-)，女，主治醫師，碩士，主要從事神經內科臨床與基礎研究。

R741.02

A

1005-9202(2017)05-1073-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.015