黃芩苷對A549肺腺癌細胞增殖的抑制作用及機制

龍 進

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院藥劑科，廣西 南寧 530000)

黃芩苷對A549肺腺癌細胞增殖的抑制作用及機制

龍 進

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院藥劑科，廣西 南寧 530000)

目的 探討黃芩苷對A549肺腺癌細胞株增殖的抑制作用及其相關機制。方法 將濃度為0、25、50、100、200、400 μmol/L的黃芩苷作用于經體外培養的A549人肺腺癌細胞株24、48、72 h，采用噻唑藍(MTT)法檢測黃芩苷對A549肺腺癌細胞的抑制率；收集30 μmol/L黃芩苷孵育24 h后的A549肺腺癌細胞，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定細胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖細胞核抗原(PCNA)及 p21 mRNA的表達水平，采用Western印跡法檢測CyclinD1、PCNA及p21蛋白的表達水平。結果 不同濃度的黃芩苷對A549肺腺癌細胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，并且呈劑量效應、時間效應關系。30 μmol/L黃芩苷(實驗組)作用于A459肺腺癌細胞24 h后，CyclinD1、PCNA及其蛋白表達水平低于對照組，p21及其蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)。結論 通過抑制CyclinD1、PCNA的表達以及促進p21的表達，黃芩苷抑制A549肺腺癌細胞增殖。

黃芩苷；A549肺腺癌細胞；增殖；抑制

肺腺癌是肺癌常見的病理類型，具有易發生遠處轉移，對放射治療反應不佳以及對化療藥物存在明顯的局限性等特點〔1〕。黃芩苷是從唇形科植物黃芩中提取分離得到的具有抗氧化、誘導干細胞分化等多種藥理作用的黃酮類化合物〔2〕。報道顯示，黃芩苷具有抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡等作用〔3〕，目前對黃芩苷的抗腫瘤機制的研究主要集中在肝細胞癌、膀胱癌以及結腸癌等惡性腫瘤〔4～6〕。關于黃芩苷對肺腺癌細胞增殖抑制的研究相對較少，本研究旨在探討黃芩苷對A549肺腺癌細胞增殖的抑制作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 A549肺腺癌細胞株(由中國科學院上海細胞研究所提供)，純度為99.1%的黃芩苷(南京青澤醫藥公司提供)，RPMI1640培養基、胎牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司提供)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖細胞核抗原(PCNA)、p21等相關的一抗(美國Santa Cruz公司提供)，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物技術公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將A549肺腺癌細胞株培養在內含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培養基中，2～3 d更換1次培養液，收集對數生長期的細胞準備實驗。

1.2.2 噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖抑制率 采用0.25%的胰蛋白酶消化對數生長期的A549肺腺癌細胞，將其細胞密度調整為1×107/L，然后接種到96孔板內，將濃度分別為0、25、50、100、200、400 μmol/L的黃芩苷加入其中孵育24、48、72 h，在培養終止前每孔加入終質量濃度為0.5 g/L的MTT繼續孵育4 h，棄去上清液，將100 μl的二甲基亞砜加入其中振蕩以充分溶解，采用酶標儀測定波長為490 nm時的吸光度(A)值并計算細胞的生長抑制率。生長抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，其中實驗組為30 μmol/L的黃芩苷，對照組為0 μmol/L的黃芩苷。每組6個復孔，實驗重復3次，計算10%細胞生長抑制時的藥物濃度(IC10)和50%細胞生長抑制時的藥物濃度(IC50)半數抑制濃度。

1.2.3 RT-PCR法測定CyclinD1、PCNA及p21 mRNA表達情況 將濃度為30 μmol/L的黃芩苷加入到A549肺腺癌細胞中孵育24 h，收集細胞并提取細胞中的RNA，在95℃下5 min預變性，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25個循環后72℃延伸10 min，嚴格按照RT-PCR試劑盒上的說明實施反轉錄以及目的片段的擴增。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對RT-PCR的擴增產物進行分離并掃描成像，采用凝膠成像分析系統對其進行分析。以未做任何處理的A549肺腺癌細胞株為對照組，GAPDH為內參照。以下為引物的序列：CyclinD1的上游引物序列為，下游引物序列為，擴增的產物是386 bp；PCNA的上游引物序列為，下游引物序列為，擴增的產物是369 bp；p21的上游引物序列為，下游引物序列為，擴增的產物是427 bp；內參照GAPDH的上游引物序列為，下游引物序列為，擴增的產物是452 bp。

1.2.4 Western印跡法測定CyclinD1、PCNA及p21蛋白表達情況 采用Bradford法測定實驗組和對照組細胞總蛋白的濃度，再分別采集40 μg各例蛋白樣本以10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，將其轉移到聚偏氟乙烯膜用5%的脫脂奶粉在室溫環境下封閉60 min，將1∶400稀釋過的一抗加入其中，在4℃環境下孵育24 h，將二抗加入其中孵育90 min后漂洗，以化學發光法進行顯色，內參照為GAPDH。BioRad圖像分析系統對蛋白條帶的A值進行測定，目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白A值/內參照蛋白蛋白A值，實驗重復3次取平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 黃芩苷對A549肺腺癌細胞增殖的抑制作用 不同濃度黃芩苷對A549肺腺癌細胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，并且呈劑量效應、時間效應關系(見圖1)；黃芩苷作用于A549肺腺癌細胞24、48、72 h的IC10分別為31、26、23 μmol/L。IC50分別為225、183、126 μmol/L，細胞抑制率≤10%是黃芩苷的非細胞毒性濃度，本研究選擇30 μmol/L作用時間24 h為實驗室的安全劑量。

2.2 黃芩苷對A549肺腺癌細胞CyclinD1、PCNA及p21 mRNA表達的影響 實驗組CyclinD1、PCNA的表達水平低于對照組，p21的表達水平高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.3 兩組A549肺腺癌細胞CyclinD1、PCNA及p21蛋白水平比較 實驗組CyclinD1蛋白、PCNA蛋白水平低于對照組，p21蛋白水平高于對照組(P<0.05)。見表2。

圖1 黃芩苷對A549肺腺癌細胞增殖的抑制作用表1 黃芩苷對A549肺腺癌細胞CyclinD1、PCNA及 p21 mRNA表達的影響

表2 比較兩組A549肺腺癌細胞CyclinD1、PCNA及 p21蛋白水平

3 討 論

目前臨床主要采取放化療治療肺腺癌，以提高惡性腫瘤患者的生活質量和延長生存時間，但報道顯示，化療藥物對患者存在不同程度的不良反應〔7〕。從天然植物中提取、分離抗腫瘤藥物成為目前抗腫瘤新藥研發的熱點，《神農本草經》載有黃芩具有瀉火解毒、清熱燥濕以及止血等功效，而現代藥理學研究表明黃芩有抗病毒、抗過敏、抗氧化以及抗腫瘤的作用〔8〕。黃芩苷是從中藥黃芩中提取、分離而來的黃酮類化合物，它可有效抑制腫瘤細胞的增殖、促進細胞的凋亡以及抗新生血管生成〔9,10〕。本研究結果提示黃芩苷具有明顯的抗肺腺癌效果，與有關研究結果一致〔11〕。肺腺癌的發病機制主要與腫瘤的細胞周期出現紊亂進而導致細胞過度的增殖、生長有關，CyclinD1通過與細胞周期蛋白激酶(CDK)4結合而啟動DNA的復制，以使細胞從G1期進入到S期來參與細胞周期的過程〔12〕，PCNA作為DNA聚合酶的附屬蛋白，可以反映細胞增殖率以及DNA的合成率，其水平越高，提示細胞增殖效果越強〔13〕，p21蛋白屬于細胞周期抑制蛋白，具有最廣泛的激酶抑制活性，它通過使Cyclin-CDK復合物的激酶活性喪失而參與腫瘤細胞的增值過程〔14〕。本研究結果說明黃芩苷通過下調CyclinD1、PCNA，上調p21水平而在抑制A549肺腺癌細胞增殖方面發揮作用，推測可能是因為黃芩苷通過多個途徑，如促進腫瘤細胞的凋亡、抑制新生血管的生成等達到抗腫瘤的目的〔15〕。

1 Masri S,Papagiannakopoulos T,Kinouchi K,etal.Lung adenocarcinoma distally rewires hepatic circadian homeostasis〔J〕.Cell,2016;165(4):896-909.

2 韋小白,董競成.黃芩苷對人肺腺癌LTEP-A2細胞的抑制作用及機制研究〔J〕.世界中醫藥,2014;9(2):213-7.

3 Wang XF,Zhou QM,Du J,etal.Baicalin suppresses migration,invasion and metastasis of breast cancer via p38MAPK signaling pathway〔J〕.Anticancer Agents Med Chem,2013;13(6):923-31.

4 Yin H,Bhattarai JP,Oh SM,etal.Baicalin activates glycine and〔Formula:see text〕-aminobutyric acid receptors on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subsnucleus caudalis in juvenile mice〔J〕.Am J Chin Med,2016;44(2):389-400.

5 Lin C,Tsai SC,Tseng MT,etal.AKT serine/threonine protein kinase modulates baicalin-triggered autophagy in human bladder cancer T24 cells〔J〕.Int J Oncol,2013;42(3):993-1000.

6 Wang CZ,Zhang CF,Chen L,etal.Colon cancer chemopreventive effects of baicalein,an active enteric microbiome metabolite from baicalin〔J〕.Int J Oncol,2015;47(5):1749-58.

7 張 鵬,李曉冰,任虎虎,等.經皮肝動脈栓塞化療聯合洛鉑熱灌注化療治療不能手術切除的肝細胞癌的近期療效觀察〔J〕.中國腫瘤臨床,2013;40(5):284-6.

8 曹慧娟,鄢云彪,戴建業,等.黃芩苷對人肺腺癌A549細胞的體內外研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2013;19(13):216-20.

9 Xi YL,Li HX,Chen C,etal.Baicalin attenuates high fat diet-induced insulin resistance and ectopic fat storage in skeletal muscle,through modulating the protein kinase B/Glycogen synthase kinase 3 beta pathway〔J〕.Chin J Nat Med,2016;14(1):48-55.

10 李 峰,王根旺,錢彬彬,等.黃芩苷對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制作用及其機制研究〔J〕.中國藥物警戒,2015;12(5):257-60.

11 鄭海峰,王英妹,武鐵軍,等.黃芩苷對人肺腺癌A549細胞的抑制作用及相關機制〔J〕.中成藥,2012;34(11):2214-6.

12 Liao K,Li J,Wang Z.Dihydroartemisinin inhibits cell proliferation via AKT/GSK3β/cyclinD1 pathway and induces apoptosis in A549 lung cancer cells〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014;7(12):8684-91.

13 李義君,劉建秋,全麗娜.通補消積飲對人肺腺癌A549細胞PCNA蛋白表達的影響〔J〕.長春中醫藥大學學報,2014;30(5):790-2.

14 Wang H,Zhu LJ,Yang YC,etal.MiR-224 promotes the chemoresistance of human lung adenocarcinoma cells to cisplatin via regulating G1/S transition and apoptosis by targeting p21(WAF1/CIP1)〔J〕.Br J Cancer,2014;111(2):339-54.

15 Yu Y,Pei M,Li L.Baicalin induces apoptosis in hepatic cancer cells in vitro and suppresses tumor growth in vivo〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(6):8958-67.

〔2016-06-16修回〕

(編輯 滕欣航)

龍 進(1964-)，男，碩士，副主任藥師，主要從事中草藥鑒定、分離、含測及醫院藥學的研究。

R73

A

1005-9202(2017)05-1094-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.024