八角楓根中1個新的生物堿及其細胞毒活性研究

邢歡歡+周堃+楊艷+周玲+董偉+王月德+馬航贏+周敏+葉艷青+胡秋芬

[摘要]對八角楓Alangium chinense 根的化學成分進行研究，運用硅膠、凝膠、MCIgel 樹脂及 RPHPLC 等多種色譜技術分離純化，并根據理化性質和波譜數據鑒定化合物的結構，同時用 MTT 法測定化合物的細胞毒活性。從八角楓根的 90%乙醇提取物中分離鑒定了 3 個生物堿類化合物 （1～3），其中化合物1為新化合物，命名為 8羥基3羥甲基6，9二甲基7H苯并[de]異喹啉7酮，其對 NB4， A549， SHSY5Y， PC3， MCF7 的 IC50分別為 42， 35， 57， 28， 39 μmol·L-1，該化合物具一定的細胞毒活性。

[關鍵詞]八角楓； 生物堿； 細胞毒活性

A new cytotoxic alkaloid from roots of Alangium chinense

XING Huanhuan， ZHOU Kun， YANG Yan， ZHOU Ling， DONG Wei， WANG Yuede， MA Hangying，

ZHOU Min， YE Yanqing， HU Qiufen*

（Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources， State Ethnic Affairs Commission & Ministry

of Education， Yunnan Minzu University， Kunming 650500， China）

[Abstract]We have carried out the chemical investigation on the roots of Alangium chinense The chemical constituents from the roots of Achinense were isolated and purified by various chromatographic techniques， such as silica gel， MCIGel resin， Sephadex LH20 and high performance liquid chromatography As a result， three alkaloids （13） were isolated from 90% EtOH extracts of the roots of this plant Their structures were elucidated by physicalchemical properties and spectral data Among them， compound 1 is a new compound， determined as 8hydroxy3hydroxymethyl6，9dimethyl7Hbenzo[de]isoquinolin7one Cytotoxicity of the compounds was evaluated by the MTT method Compound 1 displayed cytotoxicity against NB4， A549， SHSY5Y， PC3 and MCF7 cell lines with IC50 values of 42， 35， 57， 28 and 39 μmol·L-1， respectively

[Key words]Alangium chinense； alkaloid； cytotoxicity

八角楓又名白龍須、八角梧桐、五角楓等，為八角楓科八角楓屬植物Alangium chinense （Lour） Harms。八角楓（華木瓜）是一種落葉灌木或喬木，常生于溪邊、曠野及山坡陰濕雜林中，為密源植物，在我國主要分布于陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、廣東、四川、貴州、云南等地[12]。其性溫，味辛、苦，具有祛風除濕，舒筋活絡，散淤止痛之功效[3]，根和皮藥效最好。其葉用于跌打骨折，外刀傷出血；花用于頭風痛及胸腹脹滿。在云南民間常用于風濕痹痛，肢體麻木，跌打損傷。

目前國內外學者對八角楓進行過一些化學成分研究，主要報道的化合物有：倍半萜、三萜、生物堿、甾體等[45]。Zhang Yang 等[4]報道了八角楓中的生物堿及倍半萜具有抗病毒活性和抗氧化活性，為充分利用我國豐富的民族藥資源，進一步從天然植物寶庫中發掘活性化合物，本文對八角楓根的化學成分進行了研究，并從中分離到 3 個生物堿類化合物，其中化合物1為新化合物，且該化合物具有一定的細胞毒活性。

1材料

UV2401A 紫外光譜儀 （日本島津公司）；BioRad FTS185 傅里根變換紅外光譜儀 （美國伯樂BIORAD 公司）；DRX500 型核磁共振儀 （瑞士布魯克公司）；API QSTAR 飛行時間質譜 （美國應用生物公司），VG Autospec3000 高分辨質譜 （英國質譜儀器公司），半制備 HPLC 分析儀器為島津 LC8A 型高效液相色譜儀，色譜柱為安捷倫公司 Zorbax PrepHT GF （212 mm ×250 mm，7 μm） 和安捷倫 Zorbax C18 （94 mm ×250 mm，5 μm）。柱色譜硅膠 （80～100，150～200 目）、GF254 （100 mm×100 mm） 硅膠板，均為青島海洋化工廠生產；MCI 填充材料為 MCIgel CHP20P （75～150 μm）；凝膠為 Sephadex LH20；薄層色譜法顯色，顯色劑為5%H2SO4乙醇溶液，噴灑后加熱顯色；工業用三氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯。

八角楓于 2014 年 10 月采于云南大理，標本經云南民族大學民族藥資源化學重點實驗室楊青松副教授鑒定為八角楓科植物八角楓，標本 （編號2014060） 保存于云南民族大學民族藥資源化學重點實驗室標本館。

2提取與分離

取八角楓根 25 kg 曬干，粉碎，過 30 目篩，然后用 90%乙醇水溶液超聲提取 4 次（每次用 35 L 的 90%乙醇水溶液室溫浸泡 7 d后超聲 30 min 提取），濾過，合并提取液，用 3%酒石酸溶液10 L稀釋后用乙酸乙酯萃取3次。水相用氫氧化鈉調節 pH 為 90～100 后再用乙酸乙酯萃取 3 次，將乙酸乙酯相減壓濃縮得浸膏 186 g。浸膏用 20 g 粗硅膠 （80～100 目） 拌樣，烘干，用 120 g硅膠 （150～200 目） 經柱色譜分離，三氯甲烷丙酮 （20∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5） 梯度洗脫，分成 6 個部分。將三氯甲烷丙酮 8∶2 洗脫部分用甲醇溶解，采用 Agilent 公司的 Zorbax PrepHT GF （212 mm ×250 mm，7 μm） 反相柱，以 52% 甲醇水溶液為流動相，體積流量為 15 mL·min-1，收集 315 min 的色譜峰，得化合物2粗品，收集 286 min 的色譜峰，得化合物 1 粗品，收集 262 min 的色譜峰，得化合物 3 粗品。粗品再以甲醇為流動相，用葡聚糖凝膠柱 Sephadex LH20 純化得化合物 1 （115 mg），2 （128 mg），3 （146 mg），見圖1。

3結構鑒定

化合物1為橙紅色膠狀物，UV λ（nm）： 210 （428），246 （376），342 （382）； IRν（cm-1）： 3 412，3 185，2 963，1 650，1 610，1 567，1 462，1 385，1 310，1 267，1 135，1 032，861，728； ESIMS m/z 278 [M+Na]+，HRESIMS m/z 278079 8 [M+Na]+ （計算值 278079 3，C15H13NNaO3）。結合1H 和13CNMR 譜確定分子式為 C15H13NO3，不飽和度為 10。其紅外光譜顯示化合物中有羥基 （3 412 cm-1）、羰基 （1 650 cm-1） 和芳環 （1 610，1 567，1 462 cm-1） 信號，紫外光譜在 246，342 nm 有最大吸收也證實化合物中存在芳環結構。從1HNMR 譜 （數據歸屬見表1） 信號可以看出化合物中有 3 個芳香族氫信號 [δH 848 （1H，s），801 （1H，d，J=81 Hz），767 （1H，d，J=81 Hz）]；2 個甲基信號 [δH 251 （3H，s） 和 280 （3H，s）]；1 個氧化亞甲基信號 [δH 462 （2H，s）]；以及 1 個酚羥基信號 （δH 1042，br s）。化合物的13CNMR 和 DEPT 譜顯示該化合物含有 8 個芳香季碳 （δC 1253 s，1316 s，1466 s，1247 s，1512 s，1230 s，1507 s，1202 s）；3 個芳香次甲基 （δC 1426 d，1280 d，1343 d）；1 個 α，β不飽和羰基 （δC 1811 s）；2 個甲基 （δC 105 q 和 248 q）；以及 1 個氧化的亞甲基 （δC 669 t）。通過 HSQC 譜對化合物的碳氫信號進行了一一對應歸屬。在 HMBC 譜中，見圖2，觀測到了 H13 和 C5、C6、C6a，H5 和 C3a、C6a、C4，H4 和 C3、C3a、C11，H212 和 C2、C3、C3a，以及 H2 和 C3、C3a、C12、C10 的相關，可證實化合物中存在 3羥甲基6甲基異喹啉的結構片斷。進一步通過 H14 和 C8、C9、C10 的 HMBC 相關，可推測 α，β不飽和羰基中的 β碳 （C9） 與 C14 甲基及異喹啉環的 C10 位相連。酚羥基取代在 C8 位可根據 C8 的化學位移值 （δC 1512 s） 在低場，以及酚羥基信號 （δH 1042） 和 C7、C8、C9 的 HMBC 相關確定。此外，C6a 的化學位移 （δC 1247） 偏高場，推測 C6a 可能連接在羰基中的 α碳 （C7），同時結合該化合物還有1個不飽和度，從而確定 C6a 和羰基 （C7） 直接連接形成 1 個六元環。另外，化合物 1 和文獻[4]報道的化合物 8hydroxy3，6，9trimethyl7Hbenzo[de]quinolin7one 非常相似，和文獻報道化合物相比，化合物 1 中多了 1 個羥甲基信號，而少了 1 個甲基信號，而且上述 HMBC 相關證明羥甲基取代在母核的 C3 位，證明化合物 1 為文獻化合物甲基 （C12） 被氧化為羥甲基的產物，這進一步證實了化合物 1 的結構。至此該化合物的結構得以確定，并命名為8羥基3羥甲基6，9二甲基7H苯并[de]異喹啉7酮。

邢歡歡等：八角楓根中一個新的生物堿及其細胞毒活性研究

化合物2分子式為C16H12N2O3，1HNMR （C5D5N，500 MHz） δ： 866 （1H，d，J=56 Hz，H2）， 783 （1H，d，J=56 Hz，H3），768 （1H，m，H8），731 （1H，m，H9），742 （1H，m，H10），752 （1H，m，H11），389 （3H，s，OMe13），382 （3H，s，OMe14）； 13CNMR （C5D5N，125 MHz） δ： 1465 （C2），1183 （C3），1085 （C4），1316 （C5），1368 （C6），1332 （C7），1187 （C8），1245 （C9），1202 （C10），1126 （C11），1348 （s），1484 （C13）， 1457 （C14），1669 （C15），546 （OMe13），608 （OMe14）。通過其波譜數據與文獻對比，鑒定為4，5dimethoxycanthin6one[6]。

化合物3分子式為C17H20N2O2，1HNMR （C5D5N，500 MHz） δ： 182 （2H，m，H3），211 （1H，d，J=140 Hz，H4），166 （1H，m，H4），184 （1H，m，H5），168 （1H，m，H5），287 （1H，m，H6），278 （1H，d，J=11 Hz，H6），864 （1H，s，H2′），776 （1H，d，J=75 Hz，H4′），722 （1H，dd，J=50，80 Hz，H5′），848 （1H，dd，J=15，50 Hz，H6′），678 （1H，d，J=80 Hz，H3″），682 （1H，m，H4″）， 715 （1H，m，H5″），696 （1H，d，J=80 Hz，H6″），394 （1H，d，J=170 Hz，H7″）； 336（1H，d，J=170 Hz，H7″）； 13CNMR （C5D5N，125 MHz） δ： 911 （C2），256 （C3），412 （C4），214 （C5），493 （C6），1468 （C2′），1399 （C3′），1348 （C4′），1238 （C5′），1480 （C6′），1516 （C1″），1194 （C2″），1283 （C3″），1210 （C4″），1293 （C5″），1169 （C6″），486 （C7″）。通過其波譜數據與文獻對比，鑒定為2hydroxyNhydroxybenzylanabasine[4]。

4化合物的細胞毒活性

由于多數文獻報道生物堿類化合物具有明顯的細胞毒活性，因此對化合物 1 進行了細胞毒活性篩選。細胞毒活性檢測采用改良的 MTT 測定法[7]，以紫杉醇為陽性對照藥，采用 5 種人源癌細胞株 （NB4，A549，SHSY5Y，PC3，MCF7），紫杉醇的 IC50分別為003，002，005，005，003 μmol·L-1，化合物 1 的 IC50分別為42，35，57，28，39 μmol·L-1，結果表明化合物 1 對所測試的人源腫瘤細胞增殖具有一定的細胞毒活性。

[參考文獻]

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[3]熊難茜，查俊苗藥八角楓的研究進展[J]科協論壇，2013 （8）： 108

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[6]Kondo Y， Takemoto T The structure of a new βcarboline alkaloid from Picrasma ailanthoides Planchon[J] Chem Pharm Bull，1973， 214： 837

[7]Hu Q F， Zhou B， Ye Y Q， et al Cytotoxic deoxybenzoins and diphenylethylenes from Arundina graminifolia[J] J Nat Prod， 2013， 76 （10）： 1854[責任編輯丁廣治]

[收稿日期]20160909

[基金項目]國家自然科學基金項目 （21362044，21032085）；云南省高校科技創新團隊項目（IRTSTYN 201411）；2016年云南民族大學研究生創新基金科研項目（2016YJCXS13）

[通信作者]*胡秋芬，教授，碩士生導師， Tel： （0871）68329045， Email： huqiufena@aliyuncom