清腸溫中方對潰瘍性結腸炎大鼠干擾素γ誘導蛋白10的影響＊

毛堂友，史 瑞，謝添弘，郭 一，陳 晨，石 磊，賈博宜，劉佳麗，譚 祥，韓亞飛，丁龐華，李軍祥

（北京中醫藥大學東方醫院脾胃肝膽科 北京 100078）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不十分清楚的結腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病[1,2]，好發于年輕人，其腹痛、腹瀉、黏液膿血便的臨床主癥嚴重影響患者的生活質量，被世界衛生組織列為現代難治病之一[3]。本課題組前期研究[4]發現，清腸溫中方能夠明顯改善潰瘍性結腸炎患者的臨床癥狀，抑制炎癥反應，修復腸粘膜損傷，總有效率為93.48%。但具體的作用機制尚不清楚。研究[5]顯示，干擾素γ誘導蛋白10（Interferon gamma inducible protein 10，IP10）介導的炎癥反應，是導致潰瘍性結腸炎發病的主要機制之一。因此，本研究將從IP10及IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ等炎癥因子入手，探討清腸溫中方治療潰瘍性結腸炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠，雄性，SPF級，體重（200±20）g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2011-0004），常規飼養于中國中醫科學院中藥研究所SPF級動物房，12小時光照/黑夜循環，溫度（20-24）℃，濕度50-60%；自由飲食飲水飼養。

1.2 藥物

清腸溫中方的方藥組成：黃連，炮姜，苦參，三七，青黛，煨木香，地榆炭，炙甘草，劑型為配方顆粒，由北京中醫藥大學東方醫院配方顆粒藥房統一購自于北京康仁堂藥業有限公司，保證所用藥品為同一批次，并進行鑒定質控。按實驗動物與人體體表面積比等效量核算比率，計算動物的等效劑量。實驗時以燒開的去離子水配制成所需濃度，放冰箱保存，每天配藥一次。美沙拉嗪腸溶片（mesalazine，商品名：莎爾福）購自德國Losan Pharma GmbH公司。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潛血試紙（珠海貝索生物技術有限公司）；大鼠IL-1α酶聯免疫試劑盒（Multiscience，EK301A2/2），大鼠IL-1β酶聯免疫試劑盒（Multiscience，EK301B2/2），大鼠IL-6酶聯免疫試劑盒（Multiscience，EK3062/2），大鼠TNF-α酶聯免疫試劑盒（Multiscience，EK3821/2），大鼠INF-γ酶聯免疫試劑盒（Multiscience，EK3802/2），IP10抗體（abcam，Ab7206），Beta actin抗體（中杉金橋，TA-09）PV9000超敏二步法免疫組化檢測試劑購于北京中杉金橋生物技術有限公司。UCT型超薄切片機（德國萊卡公司），顯微鏡（尼康顯微鏡ECLIPSE LV100POL/50IPOL，日本），全自動多功能酶標儀（MULTISKAN MK3，美國），電熱恒溫培養箱（DH4000A，天津）等。

1.4 分組、造模及標本采集

本課題組的動物模型建立方法如前期研究[6]，繼續采用自由飲用4.5%DSS溶液制備潰瘍性結腸炎大鼠模型，將70只健康SPF級雄性SD大鼠（體重200±20 g）適應性飼養1周后，以4.5%DSS(MW：36 000-50 000，MP Biomedical)溶液自由飲水7天，普通飼料喂養，晝/夜12/12 h交替，溫度25℃，濕度60%。同時運用隨機數字表法將大鼠隨機均等分為6組：正常組，模型組，清腸溫中方低劑量組（0.3 g/kg/day），清腸溫中方中劑量組（0.6 g/kg/day），清腸溫中方高劑量組（1.2 g/kg/day），美沙拉嗪組（0.03 g/kg/day）。造模的同時各組均以相應藥物灌胃治療7天。每日稱取大鼠體重，檢測便潛血，確保造模7天中大鼠均維持便血狀態，造模結束后查看大鼠結腸病理，結腸黏膜病變不超過黏膜下層，炎癥細胞侵潤明顯，使得模型維持在炎癥階段，避免異型增生的干預。各組大鼠，末次給藥后，禁食不禁水，24 h后取材，分離遠端結腸10 cm，-80℃凍存備用。

1.5 ELSIA法檢測結腸組織炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）的表達

將凍存的結腸解凍后，在研缽里用眼科剪切成小片，并轉入勻漿器中加入3倍生理鹽水充分勻漿，1000r，4℃離心10 min，取上清液用于檢測。

1.6 免疫組化檢測結腸IP10的表達

4 μm厚的石蠟切片經過脫蠟、復水、高壓修復、封閉后，按照試劑盒說明進行免疫組織化學染色（IP10抗體濃度1：5 000，Beta actin抗體濃度1：1 000），以PBS為陰性對照，200倍鏡視野下采集圖片，應用image pro plus 6.0軟件分析圖像，計算光密度(IOD)和染色區域總面積（area），其中以IOD表示目的蛋白表達量，以area表示目的蛋白分布及表達總面積，最后用平均光密度（IOD/area的比值）來進行統計分析。

1.7 統計學處理

所有的數據均采用SPSS 17.0統計軟件（IBM Corp，Armonk，NY，USA）分析，數據以均值±標準差 (±s)表示。符合正態分布且方差齊進行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態分布或方差不齊進行非參數檢驗，均為組間比較，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 結腸IL-1α、IL-1β

與正常組比較，模型組大鼠結腸IL-1α、IL-1β的表達水平顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸的IL-1α、IL-1β表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結腸IL-1β表達水平較模型組降低（P＜0.05），清腸溫中方低劑量組大鼠結腸IL-1α表達水平較模型組降低，但無統計學意義，見表1。

2.2 結腸IL-6、TNF-α

與正常組比較，模型組大鼠結腸IL-6、TNF-α的表達水平顯著增高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸的IL-6表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結腸IL-6表達水平較模型組降低（P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結腸TNF-α表達水平較模型組降低，但無統計學意義，見表2。

2.3 結腸INF-γ

與正常組比較，模型組大鼠結腸IFN-γ的表達水平顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸的IFN-γ表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結腸IFN-γ表達水平較模型組降低，但無統計學意義，見表3。

2.4 結腸IP10

正常組大鼠結腸組織中的IP10陽性表達很少，模型組中IP10陽性表達區域主要在腸黏膜層、黏膜肌層、肌層、漿膜層等，經過治療后，各治療組較模型組的表達相對較少，其組織切片陽性表達染色主要為深棕黃色或褐色，見圖1。與正常組相比，模型組IP10的平均光密度明顯升高（P＜0.01）；而經過干預后，清腸溫中方各劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸的IP10平均光密度較模型組顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），見表4。

表1 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IL-1α、IL-1β的影響(±s)

表1 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IL-1α、IL-1β的影響(±s)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表2 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IL-6、TNF-α的影響 (±s)

表2 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IL-6、TNF-α的影響 (±s)

注：與正常組比較,#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表3 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IFN-γ的影響 (±s)

表3 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IFN-γ的影響 (±s)

注：與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表4 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IP10的影響 (±s)

表4 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸IP10的影響 (±s)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

圖1 清腸溫中方對UC大鼠結腸IP10蛋白的影響（IHC，×200）

3 討論

目前，UC的發病機制仍未完全闡明，目前大多學者認為持續腸道感染、腸黏膜屏障缺損、腸黏膜免疫調節異常、遺傳和環境等因素共同參與了疾病發生過程[7]。其中，持續的腸道感染是導致UC發病的關鍵因素。

干擾素γ誘導蛋白10在UC的發生發展過程中發揮著重要作用。IP10屬于ELR陰性的CXC亞家族的內生趨化因子，在IFN-γ誘導下由多種細胞如成纖維細胞、內皮細胞、單核細胞、T淋巴細胞等分泌[8]，也可以在脂多糖、前炎癥因子如IFN-α/β及TNF-α等刺激下分泌[9]。CXCR3是IP10唯一的受體，IP10與CXCR3特異性結合后，能夠促進CXCR3+細胞的趨化活性[10]，從而觸發多步驟的信號轉導通路，使CXCR3陽性靶細胞T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞等向局部炎癥病灶趨化。其中，被募集的T細胞在活化后主要分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ；巨噬細胞主要分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-12、IL-23、IFN-γ等炎性因子[11]；而局部分泌增加的TN F-α、IFN-γ等炎癥因子一方面刺激產生更多IP10，進一步募集更多的免疫細胞，形成惡性循環；另一方面可直接或間接損傷腸黏膜屏障，從而損傷腸黏膜[12]，促進潰瘍性結腸炎的發生發展。

本次實驗中，模型組大鼠結腸IP10的表達水平較正常組大鼠顯著增高，這與這與既往實驗結果相一致[13，14]，同時，結腸組織的炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）也呈現高表達，表明DSS能夠誘結腸IP10的表達，促進炎癥因子的產生，從而加強炎癥反應，加重腸黏膜的損傷；而經過干預后，清腸溫中方各劑量組的IP10及炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）的表達水平均下降，說明清腸溫中方能夠通過抑制IP10的表達，下調結腸炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）的水平，從而抑制腸道抑制炎癥。

本次研究通過動物實驗探討了IP10對潰瘍性結腸炎大鼠的調控機制，對清腸溫中方治療潰瘍性結腸炎的作用機制做了初步研究，進一步深化了潰瘍性結腸炎發病機制的認識，為臨床運用清腸溫中方治療潰瘍性結腸炎提供了良好的實驗依據，但深入的作用機制有待于進一步研究。

1 Moon W.Golimumab Therapy in Ulcerative Colitis.Korean J Gastroenterol.2016.67(2):64-73.

2 Hao Y,Nagase K,Hori K,et al.Xilei San ameliorates experimental colitis in rats by selectively degrading pro-inflammatory mediators and promoting mucosal repair.Evid Based Complement Alternat Med.2014,2014(2014):569587.

3 Sclano G,Asthma.nasal polyposis and ulcerative colitis:a new perspective.Clin Exp Allergy.2002,32:1144-1149.

4 毛堂友,程佳偉,魏仕兵,等.清腸溫中方治療潰瘍性結腸炎84例.環球中醫藥,2016,9(4):479-481．

5 Lloyd M,William J S,Yuriy S,et al.Anti-IP-10 antibody(BMS-936557)for ulcerativecolitis:a phase II randomised study.Gut.2014,63(3):442-50.

6 Mao T Y,Shi R,Zhao W H,et al.Decoction Ameliorates Dextran Sulphate Sodium-Induced Ulcerative Colitis in Rats by Downregulating the IP10/CXCR3 Axis-Mediated Inflammatory Response.Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016(3):1-10.

7 劉占舉.炎癥性腸病發病機制新進展.內科理論與實踐,2013,8(1):5-8.

8 Badige R,Mitchell J A,Gashaw H,et al.Effect of Different Interferonα 2 Preparations on IP10 and ET-1 Release from Human Lung Cells.PLoS One,2012,7(10):e46779.

9 Takano S,Ishikawa E,Matsuda M,et al.Interferon-β inhibits glioma angiogenesis through downregulation of vascular endothelial growth factor and upregulation of interferon inducible protein 10.Int J Oncol,2014,45(5):1837-1846.

10 Liu M L,Guo S C,Jacqueline M,et al.CXCL10/IP-10 in Infectious Diseases Pathogenesis and Potential Therapeutic Implications.Cytokine Growth Factor Rev.2011,22(3):121-130.

11 Xu J M,Shi G P.Emerging Role of Mast Cells and Macrophages in Cardiovascular and Metabolic Diseases.Endocr,2012,33(1):71-108.

12 Ostvik A E,Granlund A V,Bugge M,et al.Enhanced expression of CXCL10 in inflammatory bowel disease:potential role of mucosal Tolllike receptor 3 stimulation.Inflamm Bowel Dis,2013,19(2):265-74.

13 Lloyd M,William J S,Yuriy S,et al.Anti-IP-10 antibody(BMS-936557)for ulcerativecolitis:a phase II randomised study.Gut.2014,63(3):442-50.

14 Singh,U,P.Singh,S,Singh,R,et al.CXCL10-producing mucosal CD4+T cells,NK cells,and NKT cells are associated with chronic colitis in IL-10mice,which can be abrogated by anti-CXCL10 antibody inhibition.J Interferon Cytokine Res.2008,28(1):31-43.