凱氏定氮蒸餾裝置-高效液相色譜法同時測定蠔油等食品中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉

賴國銀，林建忠，曾 琪，林立毅，丁亦男，張志剛，徐敦明

（廈門出入境檢驗檢疫局技術中心，福建 廈門 361026）

凱氏定氮蒸餾裝置-高效液相色譜法同時測定蠔油等食品中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉

賴國銀，林建忠，曾 琪，林立毅，丁亦男，張志剛，徐敦明

（廈門出入境檢驗檢疫局技術中心，福建 廈門 361026）

利用凱氏定氮蒸餾裝置，建立同時檢測蠔油、醬油、魚露中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的高效液相色譜法。蠔油等食品中的丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉經過磷酸酸化后轉化為相應的酸，通過凱氏定氮蒸餾裝置，水蒸氣蒸餾法提取，加磷酸調節蒸餾液pH值至3.0，采用高效液相色譜法進行測定。丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉在0.005～1.000 mg/mL內線性良好，相關系數為0.999 9。丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）、雙乙酸鈉的回收率分別為88.5%～108.3%和86.5%～108.7%，相對標準偏差為2.13%～6.42%和2.02%～6.37%（n=6）。方法簡便快捷、穩定可靠，適用于蠔油、醬油和魚露中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量的測定。

凱氏定氮蒸餾裝置；丙酸鈉（鈣）；雙乙酸鈉；蠔油；高效液相色譜

食品添加劑的使用在加工食品和方便食品中的應用已經越來越廣泛。加工食品，如蠔油、醬油、魚露在制作過程中添加防腐劑以抑制微生物生成，維持營養價值和其他特性，進而延長食品保質期[1-3]。然而，非法添加和過量添加防腐劑會使消費者有過敏反應和慢性中毒風險。因此，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》規定了所有防腐劑的最大允許添加量[4]。

蠔油[5]、醬油[6]、魚露[7]是人們餐桌上倍受歡迎的調味品。丙酸鈉（鈣）、雙乙酸鈉作為化學防腐劑，被廣泛應用于糕點、醬油等食品中。GB 2760—2014中規定，丙酸及其鈉鹽、鈣鹽在醬油中的最大允許使用量為2.5 g/kg，而蠔油、魚露中不得使用；雙乙酸鈉在蠔油、醬油和魚露中的最大使用量均為2.5 g/kg[4]。食品中丙酸的檢測方法有氣相色譜法[2,8-15]和高效液相色譜法等[11,16-18]。雙乙酸鈉的檢測方法有高效液相色譜法[19-21]和離子色譜法[22]等。林清河[23]、吳忠興[24]和項林敏[25]等報道了高效液相色譜同時測定糕點中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的方法。向文娟等[26]報道了全自動固相萃取-高效液相色譜法測定食品中的丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉。朱洪亮等[27]報道了高效液相色譜同時測定食品中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的方法。李敏等[28]報道了高效液相色譜法同時測定蒼山蒜米中雙乙酸鈉和丙酸鈣含量。2014年9月29日，我國收到了韓國通報的廈門某企業蠔油檢測出丙酸的不合格食品信息，GB 2760—2014[4]也規定蠔油中不得使用丙酸，但有關蠔油等食品中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量的檢測方法尚未見報道。

GB/T 5009.120—2003《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》[8]、GB/T 23382—2009《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定 高效液相色譜法》[16]及GB/T 23383—2009《食品中雙乙酸鈉的測定 高效液相色譜法》[19]中有關丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量檢測的蒸餾法均是稱取25 g樣品于500 mL蒸餾瓶中，蒸餾至250 mL容量瓶中，最終定容體積為250 mL。該檢測方法需樣品量大，定容體積較大，且較為費時。本實驗參考國標[16,19]規定方法基礎上改進，以蠔油、醬油和魚露為基質，采用凱氏定氮蒸餾裝置，利用高效液相色譜技術，建立了可同時檢測蠔油、醬油和魚露中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的方法，需用樣品量僅為5 g，定容體積為25 mL。該方法在丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量檢測中運用凱氏定氮蒸餾裝置，快速、簡便、準確、實用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠔油 廈門洋江食品有限公司；醬油 佛山市海天（高明）調味食品有限公司；魚露 廈門洋江食品有限公司。

甲醇為色譜純；磷酸氫二銨（純度99.0%） 德國Sigma公司；丙酸鈉（純度98.0%）、雙乙酸鈉（純度98.0%） 日本TCI公司；其余試劑均為分析純；實驗室用水為超純水。

1.2 儀器與設備

1260液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司；電子天平（感量0.1 mg和0.01 g） 德國賽多利斯公司；凱氏定氮蒸餾裝置。

1.3 方法

1.3.1 標準混合溶液配制

準確稱取1.3 g（精確至0.000 1 g）丙酸鈉，用水定容至100 mL，配制成相當于含10 mg/mL丙酸的丙酸鈉標準儲備液。準確稱取1.0 g（精確至0.0001 g）雙乙酸鈉，用水定容至100 mL，配制成10 mg/mL的雙乙酸鈉標準儲備液。依次吸取0.012 5、0.05、0.125、0.5、1.25、2.5 mL丙酸鈉及雙乙酸鈉標準儲備液于凱氏定氮蒸餾裝置，加入1 mol/L的磷酸溶液1 mL，蒸餾出約24 mL時，用1 mol/L的磷酸溶液調pH值至3左右，定容至25 mL。得到丙酸鈉（相當于丙酸）、雙乙酸鈉的混合工作液質量濃度分別為0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 mg/mL。經過0.22 μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品處理

準確稱取試樣5.00 g（精確到0.01 g）于凱氏定氮蒸餾裝置中，加入1 mL 1 mol/L的磷酸溶液，進行水蒸氣蒸餾，蒸餾液經過冷凝后，用25 mL比色管作為接收裝置，待蒸餾出約24 mL時停止接收，用1 mol/L的磷酸溶液調pH值至3左右，加水定容至25 mL，搖勻。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，供高效液相色譜測定。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Sapphire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流動相：1.5 g/L磷酸二氫銨溶液（溶劑為甲醇-水（10∶90，V/V）），用1 mol/L磷酸溶液調節pH值至2.7～3.5；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2結果與分析

2.1 流動相的確定

本實驗考察了水、甲醇-水（10∶90，V/V）、甲醇-水（15∶85，V/V）3 種溶劑，稱取1.5 g磷酸氫二銨于1 L上述溶劑中，用1 mol/L磷酸溶液調節至pH值至2.7～3.5。分別用這3 種流動相分離丙酸和雙乙酸鈉。使用純水做流動相，對色譜柱的傷害較大，丙酸的出峰時間較晚，且峰形比較寬。使用甲醇-水（15∶85，V/V）作為流動相，雙乙酸鈉的峰出峰時間過早，受基質干擾較大，且由于選用214 nm波長作為檢測波長，有機相比例過高后基線不平。最后選定甲醇-水（10∶90，V/V）作為溶劑的流動相，雙乙酸鈉和丙酸鈉出峰時間分別為4.91 min和10.18 min，如圖1所示。

圖1 丙酸和雙乙酸鈉標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standards of propionate acid and sodium diacetate

2.2 目標物餾出液體積的確定

本實驗取空白試樣5.00 g，丙酸及雙乙酸鈉加標量均為1.0 g/kg，樣品中的丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉，經磷酸酸化轉化成丙酸和乙酸，再經過水蒸氣蒸餾，冷凝管冷卻后，用比色管接收餾出液。本實驗對餾出液體積進行了優化，每個蒸餾體積均平行6 組實驗，見圖2。

圖2 丙酸、雙乙酸鈉餾出液體積與回收率關系圖Fig.2 Relationship between recoveries of propionate acid and sodium diacetate and distillate volume

由圖2可知，丙酸及雙乙酸鈉的回收率隨著餾出液體積的增加而增大，餾出液體積為10 mL時，丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的平均回收率僅有50.2%（相對標準偏差為3.2%，n=6）和52.1%（相對標準偏差為4.3%，n=6）；餾出液體積為15 mL時，丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的平均回收率僅有74.3%（相對標準偏差為2.5%，n=6）和71.9%（相對標準偏差為4.1%，n=6）；餾出液體積為20 mL時，丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的平均回收率為92.1%（相對標準偏差為4.1%，n=6）和94.5%（相對標準偏差為3.1%，n=6）；當餾出液體積達到25 mL時，丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的回收率平均分別為100.3%（相對標準偏差為2.0%，n=6）和98.2%（相對標準偏差為2.5%，n=6）。因此，選取蒸餾體積25 mL為最終定容體積。

2.3 方法的線性回歸方程及定量限測定結果

取丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）、雙乙酸鈉質量濃度0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 mg/mL的6個混合標準溶液，按照質量濃度由低到高依次進樣，以各自的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到線性回歸方程，丙酸的線性方程為y=284.58x+0.210，雙乙酸鈉的線性方程為y=236.24x+0.298。線性方程的線性相關系數均為0.999 9，丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）、雙乙酸鈉在0.005～1.000 mg/mL的線性范圍內呈現良好的線性關系。以3 倍信噪比（RSN=3）對應的目標物質量濃度為檢出限，以10 倍信噪比（RSN=10）對應的目標物質量濃度作為定量限，獲得丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）、雙乙酸鈉的儀器檢出限均為0.002 mg/mL，儀器定量限均為0.005 mg/mL。儀器的檢出限和定量限，再乘以定容體積（25 mL），除以樣品質量（5.00 g），得到方法的檢出限為0.010 g/kg，定量限為0.025 g/kg。取陰性樣品，加入丙酸鈉和雙乙酸鈉，使樣品中丙酸鈉（以丙酸計）和雙乙酸鈉的含量為0.010 g/kg，按照1.3.2節實驗方法處理樣品，測得目標物信號的信噪比大于3。取陰性樣品，加入丙酸鈉和雙乙酸鈉，使樣品中丙酸鈉（以丙酸計）和雙乙酸鈉的含量為0.025 g/kg，按照1.3.2節實驗方法處理樣品，測得目標物信號的信噪比大于10。從而確定方法的檢出限為0.010 g/kg，定量限為0.025 g/kg。

表1 本實驗建立方法與國標方法比對Table1 Comparison between the detection method used this study and the national standard method

本實驗建立方法與國標方法對比如表1所示。本實驗建立方法可同時檢測丙酸和雙乙酸鈉兩個項目，而GB/T 23382—2009和GB/T 23383—2009只可分別單獨檢測丙酸和雙乙酸鈉項目。本檢測方法需要樣品量僅為5.00 g，最終定容體積為25 mL，與國標檢測方法相比[16,19]，所需樣品量減少且定容體積減小；同時，單個樣品水蒸氣耗費時間也縮短至僅需10 min。本檢測方法的回收率能與國標方法保持一致，均在86.5%以上；方法定量限方面，丙酸由0.10 g/kg精確至0.025 g/kg，雙乙酸鈉由0.05 g/kg精確至0.025 g/kg。

2.4 方法的準確度和精密度實驗結果

分別對蠔油、醬油及魚露等進行添加回收實驗，其中蠔油為陽性樣品，丙酸的檢出量為0.132 g/kg，其余兩種為陰性樣品。按照優化的色譜條件、本方法的蒸餾方法進行加標回收實驗。加標量選取3 個水平：最低加入量選取定量限附近0.030 g/kg；第2個加入量選取最大允許使用量[4]為2.5 g/kg；第3個加入量為線性范圍外6.0 g/kg（定容后的蒸餾溶液稀釋1倍后用儀器檢測）。稱取100 g樣品3 份，分別加入3.9 mg丙酸鈉和3.0 mg雙乙酸鈉、324.3 mg丙酸鈉和250.0 mg雙乙酸鈉以及778.4 mg丙酸鈉和600.0 mg雙乙酸鈉，充分溶解，使樣品中丙酸和雙乙酸鈉的加標量為0.030、2.5 g/kg和6.0 g/kg。分別準確稱取加標試樣5.00 g（精確到0.01 g）于凱氏定氮蒸餾裝置中，按照1.3.2節方法處理測定，每個質量濃度重復6 次平行實驗，準確度和精密度結果見表2。由表2可知，3 種基質中，丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）和雙乙酸鈉的回收率分別為88.5%～108.3%和86.5%～108.7%，相對標準偏差分別為2.13%～6.42%和2.02%～6.37%。本方法的回收率高、精密度好，能夠滿足丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的檢測需要。

表2 丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）、雙乙酸鈉回收率及相對標準偏差（n=6）Table2 Recoveries and relative standard deviations (n= 6) of sodium propionate (or calcium) (calculated as propionic acid) and sodium diacetate

3 討論與結論

蠔油是一種風味獨特的調味品，它具有天然的海產品風味、鮮美濃郁的滋味，而且使用方便，營養豐富，富含Ca、Fe、Zn、Se等微量元素[5]。醬油是人們生活中常用的調味品之一，而且它除了調味作用外，還具有抗氧化等營養保健作用[6]。魚露富含多種氨基酸以及Cu、Cr、Zn、I等微量元素，不僅有獨特的海鮮風味，還有抗氧化、降血壓、降低膽固醇等功能特性。蠔油、醬油、魚露都是人們餐桌上倍受歡迎的調味品[7]，而其中食品添加劑含量的檢測和監控是保障食品安全的重要途徑。本研究結合凱氏定氮蒸餾裝置，建立了可同時檢測蠔油、醬油和魚露中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量的高效液相色譜法，蠔油中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量的檢測方法。

本研究以蠔油、醬油和魚露為基質，參考國標規定方法，并結合本實驗室對分析方法的驗證經驗，方法學驗證指標包括流動相的確定、目標物蒸餾體積的確定、線性方程、定量限、準確度和精密度。本研究考察了3 種流動相，最終選定甲醇-水（10∶90，V/V）作為溶劑流動相，雙乙酸鈉和丙酸鈉出峰時間分別為4.91 min和10.18 min，基線平穩，峰形和出峰時間穩定；同時，考察4 種餾出液體積，最終確定餾出液體積為25 mL，丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的回收率可分別達到100.3%和98.2%。本方法的檢出限為0.010 g/kg，定量限為0.025 g/kg；在3 種基質中，丙酸鈉（鈣）（以丙酸計）和雙乙酸鈉的回收率分別為88.5%～108.3%和86.5%～108.7%，相對標準偏差為2.13%～6.42%和2.02%～6.37%，均能滿足丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉的檢測需要。

綜上所述，本方法極大節約了樣本處理時間，基質干擾少，操作簡便；方法的線性關系良好、回收率高、定量限低、重復性好；實用性強，可同時適用于蠔油、醬油和魚露中丙酸鈉（鈣）和雙乙酸鈉含量的測定。

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Simultaneous Determination of Sodium (or Calcium) Propionate and Sodium Diacetate in Oyster Sauce and Other Similar Seasonings by High Performance Liquid Chromatography Using Kjeldahl Distillation Apparatus

LAI Guoyin, LIN Jianzhong, ZENG Qi, LIN Liyi, DING Yinan, ZHANG Zhigang, XU Dunming
(Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China)

Using a Kjeldahl distillation apparatus, a method for the simultaneous determination of sodium (or calcium) propionate and sodium diacetate in oyster sauce, soy sauce and fi sh sauce by high performance liquid chromatography (HPLC) was established. The sodium (or calcium) propionate and sodium diacetate in samples were converted to the corresponding acids by treatment with phosphoric acid. After that, both acids were collected by steam distillation using a Kjeldahl apparatus. The pH of the distillates was then adjusted to around 3.0 by adding phosphoric acid. Finally, the analysis was completed with HPLC. A good linear relationship was gained in the range from 0.005 to 1.000 mg/mL with a correlation coeff i cient of 0.999 9. Recoveries of sodium (or calcium) propionate and sodium diacetate were 88.5%–108.3%% and 86.5%–108.7% with relative standard deviations (RSDs) of 2.13%–6.42% and 2.02%–6.37% (n = 6), respectively. This method is simple, rapid, easy to operate, stable, reliable, and suitable for the determination of sodium (or calcium) propionate and sodium diacetate in oyster sauce, soy sauce, fi sh sauce and other liquid seasonings.

Kjeldahl distillation apparatus; sodium (or calcium) propionate; sodium diacetate; oyster sauce; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201704044

TS207.3

A

1002-6630（2017）04-0270-05

賴國銀, 林建忠, 曾琪, 等. 凱氏定氮蒸餾裝置-高效液相色譜法同時測定蠔油等食品中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 270-274. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704044. http://www.spkx.net.cn

LAI Guoyin, LIN Jianzhong, ZENG Qi, et al. Simultaneous determination of sodium (or calcium) propionate and sodium diacetate in oyster sauce and other similar seasonings by high performance liquid chromatography using Kjeldahl distillation apparatus[J]. Food Science, 2017, 38(4): 270-274. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704044. http://www.spkx.net.cn

2016-06-05

福建省自然科學基金項目（2016J05045）；國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2016IK186）

賴國銀（1984—），男，工程師，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：gylai_ustc@163.com