傳統(tǒng)酸肉中可降低膽固醇乳酸菌的分離篩選及鑒定

劉曉強(qiáng)

摘要 通過(guò)不同培養(yǎng)基篩選傳統(tǒng)酸肉中能夠降低膽固醇的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：有36株降膽固醇乳酸菌從傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中分離出來(lái)，其中菌株CT24的降膽固醇能力最強(qiáng)，膽固醇降低率達(dá)31.23%，對(duì)應(yīng)降膽固醇的量為62.89 ？滋g/mL。經(jīng)對(duì)菌株CT24進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生化指標(biāo)鑒定，初步確認(rèn)該菌為消化乳桿菌。

關(guān)鍵詞 傳統(tǒng)酸肉；降膽固醇乳酸菌；分離；篩選；鑒定

中圖分類號(hào) TS251 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）03-0238-01

Abstract The Lactobacillus which could reduce cholesterol was screened by different culture media from traditional acid meat.The results showed that there were 36 strains Lactobacillus which separated from traditional acid meat，and cholesterol reducing ability of the strain CT24 was the strongest，the cholesterol reduction rate was up to 31.23%，and the amount of cholesterol reduction was about 62.89 ？滋g/mL.After the morphological observation and biochemical identification of the strain CT24，it was confirmed that the bacteria were Lactobacillus.

Key words traditional acid meat；cholesterol reducing Lactobacillus；isolation；screening；identification

生活在我國(guó)貴州省荔波縣一帶的布依族，有一種獨(dú)特的食肉方法，即用生鮮豬肉腌制酸肉，每片肉上略帶幾粒米或花椒顆，味清香，食之皮脆，肉鮮，酸味適中，香氣四溢，清爽上口，無(wú)油膩感。有相關(guān)研究表明，這種經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)發(fā)酵后的豬肉中滋生著大量的微生物。本研究旨在純化這些微生物，以尋找具有能夠降低膽固醇的乳酸菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材與試劑。傳統(tǒng)酸肉，購(gòu)自貴州省荔波縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。供試試劑：生理鑒定用麥芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖等糖（醇）類藥品均為分析純，購(gòu)自天津制藥有限公司；牛血清白蛋白、蛋白胨等（生化試劑），上海博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；肌醇等（生化試劑）、考馬斯亮藍(lán)G-250等（均為分析純），膽固醇、磷酸氫二鉀，天津市富龍化工試廠提供。

1.1.2 供試儀器與設(shè)備。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高壓滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海恒科技有限公司）、722分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、pH計(jì)（梅特勒一托利多儀器有限公司）、光學(xué)顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1.1.3 試驗(yàn)用培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基；鑒定培養(yǎng)基：葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)用培養(yǎng)基、膽固醇膠束高膽固醇培養(yǎng)基（高膽固醇培養(yǎng)基Ⅱ）、PY培養(yǎng)基、雞蛋高膽固醇培養(yǎng)基（高膽固醇培養(yǎng)基Ⅰ）、明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基、碳酸鈣-MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膽固醇含量的測(cè)定。參照《食品中膽固醇的測(cè)定》（GB/T 5009.128—2003）進(jìn)行膽固醇含量的測(cè)定。以吸光度（A560 nm）為縱坐標(biāo)，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到y(tǒng)=0.005 9x-0.007 8（R2=0.991 6）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 乳酸菌的分離鑒定。乳酸菌的分離參考《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35—2010）方法實(shí)施。參照《乳酸細(xì)菌分離鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》以及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 篩選菌株降膽固醇作用初步研究。

（1）粗酶液提取[1-2]。收集CT24菌株培養(yǎng)的上清液和菌體沉淀液，分別對(duì)其進(jìn)行濃縮和離心，然后向其中添加體積分?jǐn)?shù)為0.4%、0.6%、0.9%、1.2%、1.6%、2.0%的TritonX-100，4 ℃條件下靜置4～5 h，分別檢測(cè)上述上清液的酶活力和蛋白質(zhì)的含量；分別取等量的8份上清液分別添加能使溶液飽和度達(dá)到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸銨進(jìn)行靜止沉淀，4 ℃條件下靜置過(guò)夜后棄去上清液，檢測(cè)沉淀的酶活力和蛋白質(zhì)含量。

（2）酶活力測(cè)定。將膽固醇溶液、酶溶液、ATP鹽溶液放入具塞試管中，振蕩混勻后在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min左右，測(cè)定560 nm吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到膽固醇含量，以被酶降解的膽固醇量反映酶活力。酶活力計(jì)算公式如下：

酶活力（U/mL）=

式中：K為酶溶液稀釋倍數(shù)；m為轉(zhuǎn)化膽固醇（？滋g）；V為液體容積（mL）；T為反應(yīng)時(shí)間（h）。

（3）蛋白質(zhì)含量測(cè)定。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法來(lái)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及降膽固醇乳酸菌的初篩

在碳酸鈣培養(yǎng)基上挑選出具有典型乳酸菌菌落形態(tài)的菌株，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24～48 h，劃線純化3代后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

將36株經(jīng)純化的乳酸菌菌株分別標(biāo)識(shí)為CT1—CT36，加入高膽固醇培養(yǎng)基Ⅰ進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定膽固醇降低情況，未添加菌種的培養(yǎng)液中膽固醇量為201.37 ？滋g/mL，菌株CT24膽固醇降低率達(dá)31.23%，對(duì)應(yīng)降膽固醇的量為62.89 ？滋g/mL，其他菌株降低膽固醇的量極低，均低于12%。

2.2 篩選菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選出的CT24菌株在MRS培養(yǎng)基平板上劃線純化，并對(duì)其進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果顯示其個(gè)體形態(tài)為細(xì)胞桿，G+，菌落乳白色，邊緣濕潤(rùn)光滑，不透明。

2.3 篩選菌株的生理生化性質(zhì)

對(duì)篩選菌株CT24生理生化進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 篩選結(jié)果

參照《乳酸細(xì)菌分離鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》以及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[3]第八版，初步鑒定CT24為消化乳桿菌。

3 結(jié)論

該研究篩選出一株有較強(qiáng)降低膽固醇能力的乳酸細(xì)菌——消化乳桿菌。該菌株來(lái)自于食用安全較高的傳統(tǒng)酸肉，同時(shí)該菌株能夠符合作為發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的主要特征[4-10]，具有潛在的工業(yè)化推廣的價(jià)值。但是該菌株能夠降低膽固醇的原理尚不明確，需要進(jìn)一步研究[11-14]。

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