紅芪多糖對模型小鼠糖尿病心肌病心肌纖維化和基質(zhì)金屬蛋白酶2及其抑制劑表達的影響

王東旭+金智生+張花治+和彩玲+南向萍+石桂珍+楚惠媛

摘要：目的 觀察紅芪多糖（HPS）對模型小鼠心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）及其抑制劑（TIMP-2）表達的影響，探討其防治糖尿病心肌病心肌纖維化的作用機制。方法 將60只實驗小鼠隨機分為模型組、羅格列酮組和HPS高、中、低劑量組，正常組為12只同周齡同背景的非轉(zhuǎn)基因雄性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠。各組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)8周。給藥前及給藥2、4、6、8周末檢測小鼠血糖；Masson染色觀察心肌纖維化程度；蛋白印跡法檢測心肌組織MMP-2、TIMP-2的蛋白表達。結(jié)果 與模型組比較，HPS高、中劑量組和羅格列酮組小鼠血糖明顯下降。Masson染色結(jié)果顯示，模型組小鼠心肌間質(zhì)中亮綠色纖維較正常組明顯增多，HPS高劑量組、羅格列酮組較模型組有所減少。蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠MMP-2表達明顯降低，TIMP-2表達明顯升高，MMP-2/TIMP-2比值下降；與模型組比較，HPS高、中劑量組和羅格列酮組小鼠MMP-2表達明顯升高，TIMP-2表達明顯降低，MMP-2/TIMP-2比值上升。結(jié)論 HPS可減輕模型小鼠糖尿病心肌病心肌纖維化程度，其治療作用可能是通過升高MMP-2/TIMP-2比值，從而使模型小鼠心肌纖維化有所減輕。

關(guān)鍵詞：糖尿病心肌病；紅芪多糖；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0057-04

Effects of HPS on Myocardial Fibrosis and Expression of MMP-2/TIMP-2 in Model Mice of Diabetic Cardiomyopathy WANG Dong-xv， JIN Zhi-sheng， ZHANG Hua-zhi， HE Cai-ling， NAN Xiang-ping， SHI Gui-zhen， CHU Hui-yuan （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To observe the effects of hedysari polysaccharide （HPS） on myocardial fibrosis and the expression of MMP-2/TIMP-2 in model mice of diabetic cardiomyopathy； To discuss the mechanism of action of prevention and treatment of myocardial fibrosis in diabetes. Methods Sixty mice were randomly divided into model group， rosiglitazone group and HPS high-， mediume- and low-dose groups. The normal group was 12 non-transgenic male BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju mice with the same age. Each group was given relevant medicine for gavage， for 8 weeks. Blood glucose of mice before and after medication 2， 4， 6， and 8 weeks was detected. The levels of MMP-2， MMP-2 and MMP-9 in myocardium were measured by Masson staining. The protein expressions of MMP-2 and TIMP-1 in myocardium were detected by Western blot. Results Compared with the model group， the blood glucose of HPS （high- and medium dose） groups and rosiglitazone group decreased significantly. Masson staining showed that the green fibers in the model group significantly increased and rosiglitazone group and HPS high-dose group decreased compared with the model group. Western blot showed that the expressions of MMP-2 in model group and MMP-2/TIMP-2 ratio were declined significantly， while the expression of MMP-2 was increased and TIMP-2 was decreased significantly， and the ratio of MMP-2/TIMP-2 increased in rosiglitazone group and HPS high- and medium-dose group. Conclusion HPS may reduce the degree of myocardial fibrosis in model mice with diabetic cardiomyopathy. The therapeutic effect of HPS may be to relieve myocardial fibrosis in model mice by increasing the ratio of MMP-2/TIMP-2.endprint

Key words： diabetic cardiomyopathy； hedysari polysaccharide； MMP-2； TIMP-2； mice

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為糖尿病（diabetes mellitus，DM）狀態(tài)下一種獨立的心血管病變，最終可演變?yōu)槌溲孕牧λソ撸跽呖砂l(fā)生猝死，是DM患者死亡的主要原因之一。DCM具體的發(fā)病機制至今仍未完全闡明，但有研究表明，DCM心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展與基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）及其抑制劑（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases-2，TIMP-2）的調(diào)控紊亂密切相關(guān)[1]。本實驗以BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠為研究對象，觀察紅芪多糖（hedysari polysaccharide，HPS）對模型小鼠心肌組織MMP-2、TIMP-2蛋白表達的影響，探討其在DCM過程中防治心肌纖維化中的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SPF級BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠60只，6周齡，體質(zhì)量（30.83±2.28）g；雄性SPF級BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠12只，6周齡，體質(zhì)量（18.02±1.49）g，均由南京大學模型動物研究所提供，動物許可證號SCXK（蘇）2015-0001。分籠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗室，光照12 h明暗交替，溫度（22±1）℃、濕度（55±5）%，自由飲食飲水。

1.2 藥物

HPS由甘肅中醫(yī)藥大學藥學院負責提取，純度為87.44%；羅格列酮片，太極集團重慶涪陵制藥有限公司，批號14120060。

1.3 試劑

Masson染色試劑，蘭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號20150910）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號20160314），北京索萊寶有限公司；山羊抗兔MMP-2單克隆抗體（批號GR213052-23）、山羊抗兔TIMP-2多克隆抗體（批號GR180886-1），英國Abcam公司；GAPDH（批號ZS-257780）、山羊抗兔IgG/辣根酶標記（批號ZB-2301），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL顯色試劑（批號1414301），美國Millipore公司。

1.4 儀器

羅氏血糖儀（卓越精采型），Roche公司；CT14RD臺式高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；DNM-9602酶標分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；STS-D5磁力攪拌器，德國IKA公司；PowerPoc Basic凝膠電泳儀，美國Bio-rad公司；ChemiDocTM XRS+凝膠成像分析儀，美國Bio-rad公司。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥

60只實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量采用隨機數(shù)字表法分為模型組、羅格列酮組和HPS高、中、低劑量組，每組12只。HPS高、中、低劑量組分別給予200、100、50 mg/（kg·d）HPS灌胃，HPS用蒸餾水稀釋，按體質(zhì)量予同濃度（20 mg/mL）藥物；羅格列酮組予羅格列酮4 mg/（kg·d）灌胃。模型組和正常組（同周齡同背景非轉(zhuǎn)基因小鼠12只）均予生理鹽水（0.2 mL/d）灌胃。分組后各組小鼠均予標準飼料喂養(yǎng)，每2周測空腹血糖1次，連續(xù)8周。8周實驗結(jié)束時共剩余小鼠66只，分別為正常組12只、模型組10只、羅格列酮組11只和HPS高、中、低劑量組12、11、10只。

2.2 標本采集與處理

干預(yù)第8周末禁食、不禁水12 h后稱重，心臟取血，3000 r/min離心10 min，取上層血清，-20 ℃保存。心臟取血后處死小鼠，取出心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，剪除包膜、血管及心房組織，留取左室心肌組織、光鏡標本后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 指標檢測

2.3.1 血糖 分別于給藥前及給藥2、4、6、8周末尾靜脈取血，檢測各組小鼠空腹血糖。

2.3.2 Masson染色 取各組小鼠左室心肌組織，在4%多聚甲醛溶液中固定、石蠟包埋、切片，進行Masson染色，觀察各組小鼠心肌纖維化程度。

2.3.3 基質(zhì)金屬蛋白酶2及其抑制劑表達檢測 稱取左室心肌組織50 mg，按試劑盒說明提取蛋白，測蛋白濃度后，蛋白變性。每樣品孔上樣40 μg總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別加入MMP-2一抗（稀釋度為1∶500）、TIMP-2一抗（稀釋度為1∶500）和GAPDH一抗（稀釋度為1∶1000），4 ℃過夜。TBST洗膜10 min×3次，將膜置于山羊抗兔辣根酶標記的二抗中（稀釋度為1∶5000），室溫孵育90 min，TBST洗膜10 min×3次。ECL化學發(fā)光液顯影后，用凝膠成像分析儀采集信號并攝像。Western blot圖像用Image J分析軟件對各組條帶進行分析，將各組整合灰度值與內(nèi)參（GAPDH）比較（目的蛋白ID/內(nèi)參ID）即得MMP-2、TIMP-2的相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析，多組間比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 紅芪多糖對模型小鼠血糖的影響

與正常組比較，模型組小鼠血糖明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，各干預(yù)組血糖均有所下降，羅格列酮組和HPS高、中劑量組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。endprint

4.2 紅芪多糖對模型小鼠心肌纖維化程度的影響

正常組小鼠心肌間質(zhì)及血管周圍可見少量亮綠色膠原纖維；模型組小鼠心肌間質(zhì)、血管周圍亮綠色膠原纖維明顯增多且排列紊亂；HPS高劑量組、羅格列酮組小鼠心肌間質(zhì)亮綠色膠原纖維較模型組明顯減少。結(jié)果見圖1。

4.3 紅芪多糖對模型小鼠心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶2及其抑制劑蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組MMP-2蛋白表達明顯降低，TIMP-2蛋白表達明顯升高，MMP-2/TIMP-2比值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，羅格列酮組和HPS高、中劑量組MMP-2蛋白表達明顯升高，TIMP-2蛋白表達明顯降低，MMP-2/TIMP-2比值明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見圖2、圖3。

5 討論

DCM作為一種特異性的心血管病變，早期主要以左室舒張功能異常為主，晚期則表現(xiàn)為左室收縮功能障礙[2-3]，最終可引起心肌廣泛灶性壞死。其主要病理改變包括心肌細胞外基質(zhì)堆積、心肌肥厚及心肌間質(zhì)纖維化[4]。其中，心肌間質(zhì)纖維化可導(dǎo)致心臟順應(yīng)性降低，進而引起心臟收縮及舒張功能障礙。本實驗Masson染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組心肌間質(zhì)及血管周圍的亮綠色膠原纖維明顯增多且排列紊亂，膠原沉積現(xiàn)象明顯，表明模型組小鼠心肌組織存在明顯的心肌纖維化。

有研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）的調(diào)控紊亂與DCM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。MMPs能有效降解心肌細胞外基質(zhì)，其中MMP-2在心肌組織中表達水平較高，是抗心肌纖維化的主要成分[6]。TIMPs能通過其N-末端的功能區(qū)與MMPs催化活性中心的鋅離子發(fā)生特異性結(jié)合，從而使有活性的MMPs失活或避免無活性的MMPs激活[7]。TIMP-2作為MMP-2的天然抑制物，也存在于心肌組織中，可通過結(jié)合相應(yīng)的MMP-2而影響心肌組織的活性，二者的平衡對維持心肌組織正常的膠原代謝意義重大[8]。

HPS是甘肅道地藥材紅芪的提取物，主要有減輕胰島素抵抗[9]、調(diào)節(jié)免疫[10]等作用。課題組前期實驗研究表明，HPS可通過調(diào)節(jié)模型小鼠腎臟組織血管內(nèi)皮生長因子、色素上皮細胞衍生因子蛋白和mRNA的表達，改善糖尿病微血管病變，減輕糖尿病腎病病理狀態(tài)，從而起到防治糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的作用[11]。本實驗結(jié)果顯示，HPS高劑量組血糖較模型組明顯降低（P<0.05），提示HPS可改善模型小鼠的血糖代謝水平；本實驗同時發(fā)現(xiàn)，模型小鼠存在廣泛的心肌纖維化，經(jīng)HPS干預(yù)治療后，HPS高劑量組小鼠心肌細胞周圍亮綠色膠原纖維較模型組明顯減少，同時心肌組織MMP-2的表達量較模型組明顯上調(diào)，TIMP-2的表達量較模型組明顯下調(diào)，MMP-2/TIMP-2比值較模型組明顯升高。這些結(jié)果均表明HPS可減輕DCM模型小鼠的心肌纖維化程度，其治療作用可能是通過升高MMP-2/TIMP-2比值，使其趨于相對平衡，從而起到降解心肌細胞外基質(zhì)，改善心肌組織活性，防治心肌纖維化的作用。

參考文獻：

[1] 符麗娟，王洪新，包翠芬，等.貝那普利對糖尿病大鼠心肌細胞外基質(zhì)重塑中基質(zhì)金屬蛋白酶及轉(zhuǎn)化生長因子表達的影響[J].中國藥理學與毒理學雜志，2011，25（3）：229-233.

[2] SCHANNWELL C M， SCHNEPPENHEI M， PERIMGS S， et al. Left ventricular diastolic dysfunction as an early manifestation of diabetic cardiomyopathy[J]. Cardiology，2002，98（1/2）：33-39.

[3] SAJAD A H，BILLAL P， RAJDEEP S， et al. Diabetic cardiomyopathy mechanisms， diagnosis and treatment[J]. Clin Sci，2004，107：539-547.

[4] TRACHANAS K， SIDERIS S， AGGELI C， et al. Diabetic cardiomyopathy from pathophysiology to treatment[J]. Hellenic J Cardiol，2014， 55（5）：411-421.

[5] 王巖，郭永川，梁前壘，等.參麥注射液對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的干預(yù)作用及相關(guān)機制探討[J].中國病理生理雜志，2014，30（3）：449-453.

[6] PENG J， LI X， FENG Q， et al. Anti-fibrotic effect of cordyceps sinensis polysaccharide：Inhibiting HSC antivation，TGF-β1/Smad signalling， MMPs and TIMPs[J]. Exp Biol Med （Maywood），2013，238（6）：668-677.

[7] FAN D， TAKAWALE A， BASU R， et al. Differential role of TIMP2 and TIMP3 in cardiac hypertrophy， fibrosis， and diastolic dysfunction[J]. Cardiovasc Res，2014，103（2）：268-280.

[8] POLYAKOVA V， LOEFFLER I， HEIN S， et al. Fibrosis in endstage human heart failure：severe changes in collagen metabolism and MMP/TIMP profiles[J]. Int J Cardiol，2011，151（1）：18-33.

[9] 金智生，李娟娥，張東鵬.紅芪多糖對實驗性T2DM大鼠胰島素抵抗和C肽分泌作用的研究[J].甘肅中醫(yī)學院學報，2007，24（1）：14-16.

[10] 毛小娟，王軍志.紅芪多糖和黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國藥理學通報，1989，5（6）：367-372.

[11] 金智生，魏玉嬌，朱真靈，等.紅芪多糖對db/db小鼠腎組織血管內(nèi)皮生長因子、色素上皮細胞衍生因子表達的影響[J].中醫(yī)雜志，2014， 55（15）：1327-1330.endprint