金櫻子不同炮制飲片化學(xué)成分及抗氧化活性分析

鄧翀+江迎春+張化為+宋小妹+姜祎+顏永剛

摘要：目的 考察蜜制和麩制對金櫻子化學(xué)成分的影響。方法 以總多酚、總皂苷、總多糖、總氨基酸為評價指標(biāo)，考察金櫻子生品、蜜制品、麩制品中4類化學(xué)成分的變化情況；以體外對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為評價指標(biāo)，比較金櫻子生品、蜜制品、麩制品的抗氧化活性。結(jié)果 金櫻子生品、蜜制品、麩制品總皂苷含量分別為3.332%、4.880%、4.572%，總酚酸含量分別為1.92%、6.38%、7.30%，總多糖含量分別為35.99%、40.38%、36.86%，總氨基酸含量分別0.67%、0.76%、0.96%。經(jīng)炮制后金櫻子總多酚、總皂苷、總多糖、總氨基酸含量均升高，其中總多酚含量升高最為明顯；金櫻子生品、蜜制品、麩制品體外清除DPPH自由基的IC50分別為0.47、0.51、0.22 mg。結(jié)論 與生品比較，金櫻子蜜制品和麩制品化學(xué)部位含量增高，抗氧化性增強。

關(guān)鍵詞：金櫻子；蜜制；麩制；化學(xué)部位；抗氧化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.018

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0071-04

Analysis on Chemical Compositions and Antioxidant Activity of Different Processing Decoction Pieces of Rosae Laevigatae Fructus DENG Chong， JIANG Ying-chun， ZHANG Hua-wei， SONG Xiao-mei， JIANG Yi， YAN Yong-gang （College of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

Abstract： Objective To investigate the honey and bran of processing for chemical compositions of Rosae Laevigatae Fructus. Methods With total polyphenols， total saponins， total polysaccharides and amino acids as the evaluation indexes， changes of the chemical compositions of these four chemical components in Raw product， honey products， bran products of Rosae Laevigatae Fructus were studied； in vitro activity of DPPH radical clearance for evaluation index， antioxidant activity of raw products， honey products， bran products of Rosae Laevigatae Fructus were compared. Results Raw products， honey products， and bran products of total saponin content were 3.332%， 4.880%， and 4.572%； total phenolic contents were 1.92%， 6.38%， and 7.30%； total polysaccharide contents were 35.99%， 40.38%， and 36.86%； the total amino acid contents were 0.67%， 0.76%， and 0.96%. Total polyphenol， total saponins， total polysaccharides， and total amino acids of Rosae Laevigatae Fructus after processing increased， in which the total polyphenol was most obvious； DPPH radical scavenging IC50 of raw products， honey products， and bran products were 0.47， 0.51， and 0.22 mg， respectively. Conclusion Compared with raw product， the content of chemical fractions in honey products and bran products of Rosae Laevigatae Fructus increase， and oxidation resistance is enhanced.

Key words： Rosae Laevigatae Fructus； honey； bran； chemical fractions； antioxidant

金櫻子為薔薇科薔薇屬植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的成熟果實，具有固精縮尿、澀腸止瀉功效，用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、崩漏帶下、久瀉久痢。金櫻子的化學(xué)成分主要為三萜、有機酸、黃酮、鞣質(zhì)、多糖等，具有提高機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗病毒等藥理活性[1]。炮制引起中藥飲片變化主要包括兩方面：一是整體化學(xué)成分變化，二是化學(xué)成分變化導(dǎo)致生物活性的改變。目前主要以幾個單體化學(xué)成分含量變化或某一兩個化學(xué)部位含量為標(biāo)準(zhǔn)評價炮制品質(zhì)量，無法合理闡釋中藥炮制變化的內(nèi)涵。本研究從整體化學(xué)成分角度出發(fā)，在前期研究[2]基礎(chǔ)上，以總多酚、總皂苷、總多糖、總氨基酸為化學(xué)評價指標(biāo)，以抗氧化為生物活性評價指標(biāo)，研究金櫻子不同炮制品的變化，為探討其炮制原理提供參考。endprint

1 儀器與試藥

UV-1102紫外分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司），GB204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，十萬分之一），HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永盛實驗儀器設(shè)備廠），SQ8200HD型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）。

金櫻子藥材購于西安市萬壽路藥材市場，經(jīng)本院王繼濤高級實驗師鑒定為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果實；沒食子酸對照品、齊墩果酸對照品、蘆丁對照品、D-葡萄糖對照品、L-谷氨酸對照品（批號分別為110831-200252、125742- 201058、0080-9705、110833-200503、070112，含量均為98%），中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號CR0032），日本東京化成工業(yè)株式社；維生素C對照品（批號2010608），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 不同炮制品的制備

2.1.1 麩制金櫻子飲片 取金櫻子生品飲片100 g，加麩量為20 g，以160 ℃溫度炒制12 min，分離金櫻子飲片與輔料，收集金櫻子麩制飲片。

2.1.2 蜜制金櫻子飲片 取金櫻子生品飲片100 g，加蜜量為25 g，悶潤3 h，以160 ℃溫度炒制10 min，收集金櫻子麩制飲片。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的D-葡萄糖、L-谷氨酸、沒食子酸、齊墩果酸對照品15.50、7.50、10.00、9.90 mg，分別以適當(dāng)?shù)娜軇┤芙猓⒎謩e配成0.62、0.75、0.20、0.99 mg/mL的對照品溶液。

精密稱取DPPH約10 mg，用70%乙醇溶解并定容于25 mL棕色量瓶中，置于4 ℃冰箱備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 ①精密稱取各供試品飲片粉末約1 g，以13倍量65%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液并濃縮揮干，以65%乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，4 ℃保存，供總多酚、總皂苷、總多糖、總氨基酸及清除DPPH測定。②精密稱取各供試品飲片粉末約0.5 g，加10倍量無水乙醇，在微沸狀態(tài)下回流提取2 h，提取液減壓回收乙醇后棄去，濾渣精密加20倍量水，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，定容于25 mL容量瓶，4 ℃保存，供多糖含量測定。

2.3 化學(xué)部位含量測定

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取齊墩果酸對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL試管中，70 ℃水浴揮干溶劑，加入5%香草醛-冰乙酸溶液（臨用新配）200 ?L及高氯酸溶液800 ?L，混勻，60 ℃恒溫水浴加熱20 min，取出，立即于冰水中冷卻10 min后加入5 mL冰乙酸，混勻，以不加樣為空白，在545 nm處測吸光度[3]。以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.962 5X-0.037 3，r2=0.999 8，表明齊墩果酸在0.198～0.693 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密量取沒食子酸對照品溶液50、100、150、200、250、300 ?L于10 mL具塞試管中，加乙醇至2 mL，加0.3%十二烷基磺酸鈉0.8 mL、0.6%FeCl3- 0.9%K3[Fe（CN）6]（1∶1）混合溶液0.4 mL，搖勻，放置5 min，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻，避光放置20 min，以不加樣為空白，于744 nm處測定[4]。以對照品溶液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=10.974X-0.002 6，r2=1，表明沒食子酸在0.01～0.06 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密量取L-谷氨酸對照品溶液40、60、80、100、120、140 ?L于10 mL具塞試管中，各加水至1 mL，加磷酸鹽緩沖液（pH=6.86）3 mL，加2%茚三酮溶液1 mL，搖勻，沸水浴20 min，流水冷卻，以不加樣為空白，在570 nm處測定[5]。以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=8.903 8X-0.104 6，r2=0.999，表明L-氨基酸在0.030～0.105 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密量取D-葡萄糖對照品溶液0.05、0.08、0.10、0.15、0.20 mL于10 mL具塞刻度試管中，加水至2 mL，加5%苯酚溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）1 mL，混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，40 ℃水浴15 min，取出，冰水浴冷卻5 min，以水為空白，于480 nm處測其吸光度[6]。以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=5.959 6X-0.005 5，r2=1，表明D-葡萄糖在0.031～0.124 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 方法學(xué)考察 按“2.2.2”項下方法，以沒食子酸、齊墩果酸、D-葡萄糖、L-谷氨酸對照品為指標(biāo)，考察總多酚、總皂苷、總多糖、總氨基酸的方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率。結(jié)果表明，測定總多酚的方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD依次為0.08%、0.26%、0.25%，平均回收率為100.8%±1.97 %；測定總皂苷的方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD依次為0.13%、0.67%、0.24%，平均回收率為101.6%±1.32 %；測定總多糖的方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD依次為0.36%、0.33%、1.93%，平均回收率為97.65%±1.63%；測定總氨基酸的方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD依次為0.65%、1.37 %、1.88 %，平均回收率為100.43%±1.02%。各指標(biāo)測定方法學(xué)考察均符合要求。endprint

2.3.3 樣品含量測定 精密量取各供試品溶液適量于10 mL具塞試管中，按“2.3.1”項下測定各化學(xué)部位含量方法操作，平行測定3次，測其吸光度，計算各化學(xué)部位含量，結(jié)果見表1～表4。可知4類化學(xué)成分含量炮制品均高于生品，其中總酚酸含量變化最為明顯。

2.4 抗氧化活性測定

精密移取不同體積供試品溶液于10 mL試管中，各加DPPH乙醇溶液0.5 mL，混合液用70%乙醇定容至5 mL，混勻，于室溫暗處反應(yīng)1 h，以乙醇為空白，在522 nm處測吸光度（A1），并測定DPPH乙醇溶液0.5 mL定容至5 mL后的吸光度（A0）及不同體積溶液定容后的吸光度（A2），計算DPPH自由基清除率。清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%[7]。結(jié)果見圖1。計算可得維生素C及金櫻子生品、蜜制品、麩制品清除DPPH自由基的IC50依次為0.02、0.51、0.47、0.22 mg。

3 討論

金櫻子三萜類化學(xué)成分主要為五環(huán)三萜皂苷類[8]，本研究結(jié)果表明，生品、蜜制品及麩制品中皂苷類化學(xué)成分含量依次為3.33%、4.88%、4.57%；加輔料炮制后皂苷含量變化的原因可能是輔料的引入及加熱過程對金櫻子組織細胞結(jié)構(gòu)的影響，從而增強了皂苷類化學(xué)成分的溶出率。金櫻子總多酚類主要包括黃酮類及鞣質(zhì)類化學(xué)成分[9]，本研究結(jié)果顯示，生品、蜜制品及麩制品中總多酚含量依次為1.92%、6.38%、7.30%，這可能與炮制加熱過程使部分鞣質(zhì)類發(fā)生水解，以及輔料麩皮含有的大量多酚類成分[10]在炮制過程中吸附或吸收于藥材組織中有關(guān)。金櫻子生品、蜜制品及麩制品中總多糖含量依次為35.99%、40.38%、36.86%，與文獻報道的多糖變化趨勢基本吻合[11]；蜜制品多糖含量變化較大的原因可能與炮制輔料蜂蜜中含有80%～90%糖類化學(xué)成分有關(guān)[12]。金櫻子生品、蜜制品及麩制品中總氨基酸含量依次為0.67%、0.76%、0.96%，炮制品總氨基酸含量高于生品原因可能與炮制輔料蜂蜜或麩皮中含有大量氨基酸和蛋白質(zhì)有關(guān)。

從體外抗氧化活性評價結(jié)果來看，金櫻子生品、蜜制品及麩制品清除DPPH自由基的IC50依次為0.51、0.47、0.22 mg。從化學(xué)成分變化趨勢來看，金櫻子抗氧化活性與總多酚和總氨基酸含量變化趨勢一致，這說明金櫻子抗氧化活性可能與多酚類，或多酚和氨基酸類含量相關(guān)。

綜上所述，金櫻子炮制過程使其主要化學(xué)成分皂苷類、多酚類、多糖及氨基酸類的含量發(fā)生變化，其體外抗氧化活性也相應(yīng)發(fā)生變化。目前對金櫻子炮制后化學(xué)成分變化的研究主要集中在多糖和黃酮，而對皂苷、總多酚、氨基酸含量變化鮮有報道，今后需進一步關(guān)注。另外，還應(yīng)結(jié)合藥效評價分析化學(xué)成分變化與藥效變化的關(guān)聯(lián)性，從而揭示金櫻子炮制原理。

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