HPLC同時測定紅花藥材中4種化學成分含量

何婷+李柯翱+季志紅+田樹革

摘要：目的 建立HPLC同時測定紅花藥材中羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素4種化學成分含量的方法。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），DAD檢測器，以0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B）進行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 ?L，檢測波長為360 nm。結果 羥基紅花黃色素A在0.077 6～0.776 0 ?g（r=0.999 9）、蘆丁在0.046 0～0.460 0 ?g（r=0.999 6）、槲皮素在0.006 4～0.064 0 ?g（r=0.999 9）、山柰素在0.012 8～0.128 0 ?g（r=0.999 7）范圍內呈良好線性關系。羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素的平均回收率分別為99.68%、99.78%、102.03%、97.03%，RSD（n=6）分別為2.29%、1.52%、1.02%、2.05%。結論 該法簡便、準確，靈敏度高，穩定性和重復性好，可用于紅花藥材的質量控制。

關鍵詞：紅花；羥基紅花黃色素A；蘆丁；槲皮素；山柰素；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.020

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0079-04

Simultaneous Determination of Four Chemical Components in Carthamus tinctorius L. by HPLC HE Ting1， LI Ke-ao2， JI Zhi-hong2， TIAN Shu-ge3 （1. College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2. Xinjiang Ciconhabo Uygur Medicine Co. Ltd.， Urumqi 830026， China； 3. Central Laboratory of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of hydroxysafflor yellow A， rutin， quercetin， and kaempferol in Carthamus tinctorius L.. Methods The Agilent ZORBAX SB-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used with diode array detection. The mobile phase was 0.5% phosphoric acid （A） and methanol （B） to separate the four components by gradient elution at 30 ℃； the flow rate was 0.8 mL/min； the injection volumn was 10 ?L； the detection wavelength was at 360 nm. Results The linear ranges of hydroxysafflor yellow A， rutin， quercetin， and kaempferol were 0.077 6–0.776 0 ?g （r=0.999 9）， 0.046 0–0.460 0 ?g （r=0.999 6）， 0.006 4–0.064 0 ?g （r=0.999 9） and 0.012 8–0.128 0 ?g （r=0.999 7）， respectively. The average recoveries of four components were 99.68% with RSD=2.29% （n=6）， 99.78% with RSD=1.52% （n=6）， 102.03% with RSD=1.02% （n=6）， 97.03% with RSD=2.05% （n=6）， respectively. Conclusion The method is convenient， accurate， sensitive， stable and repeatable， which can be a method for quality control of Carthamus tinctorius L..

Key words： Carthamus tinctorius L.； hydroxysafflor yellow A； rutin； quercetin； kaempferol； HPLC

紅花為菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，始載于《開寶本草》，在我國已有多年栽培和藥用歷史，主要分布在新疆、河南、四川、云南、浙江等地[1]。紅花具有活血化瘀、散瘀止痛、降血壓和降血脂等功效[2]。《本草綱目》記載，紅花能“活血潤燥，止痛散腫，通經”。臨床和藥理研究發現，紅花對心腦血管系統、神經系統、免疫系統等均可發揮一定作用，同時具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤、抗菌、抗氧化等多種生理活性[3-5]。

紅花的化學成分有黃酮、生物堿、聚炔、有機酸和多糖等，其中以黃酮類化合物（紅花黃色素）為主要有效成分[6-9]。2015年版《中華人民共和國藥典》[10]僅對紅花中的羥基紅花黃色素A和山柰素進行了含量測定，未對其他成分進行研究。為更好開發和合理利用紅花資源，本試驗以新疆紅花為研究對象，采用HPLC同時測定紅花藥材中4種化學成分含量，為有效控制藥材質量、提高紅花質量標準提供依據。endprint

1 儀器與試藥

Agilent 1220 LC高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），美國Agilent公司；WondaSil C18 Superb色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），島津技邇（上海）商貿有限公司；Waters 2690- 2487型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），北京迪馬科技有限公司；火星牌O型玻璃儀器氣流烘干器，鄭州長城科工貿有限公司；KQ-5200DE型數控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FW-200高速萬能粉碎機，天津泰斯達公司；XS105型萬分之一電子天平，德國梅特勒-托利多儀器有限公司；B-260型水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠。

羥基紅花黃色素A、蘆丁、山柰素對照品（批號分別為111637-200905、100080-200707、110861- 201310），中國食品藥品檢定研究院；槲皮素對照品（批號YA0806YB13），上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，磷酸為優級純，天津市富宇精細化工有限公司；水為超純水。紅花藥材（S1為2015年產于新疆吉木薩爾縣，S2為2015年產于新疆塔城縣，購自新疆奇康哈博維藥股份有限公司；S3為2016年產于新疆霍城縣，購自安徽濟順中藥飲片有限公司；S4為2016年產于新疆吉木薩爾縣，S5為2016年產于新疆塔城縣，購自國藥集團新疆新特克拉瑪依藥業有限公司；S6為2016年8月采摘于和田墨玉縣），經新疆醫科大學中醫學院中藥鑒定教研室徐海燕副教授鑒定為菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B）進行梯度洗脫（0～10 min，40%～40%B；10～15 min，40%～45%B；15～20 min，45%～50%B；20～45 min，50%～50%B）；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 ?L；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃。在該色譜條件下，理論塔板數按羥基紅花黃色素A峰計算不低于3000。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取經105 ℃干燥2 h后的羥基紅花黃色素A對照品、蘆丁對照品、槲皮素對照品、山柰素對照品適量，加甲醇制成含羥基紅花黃色素A 77.6 ?g/mL、蘆丁46.0 ?g/mL、槲皮素6.4 ?g/mL、山柰素12.8 ?g/mL的混合對照品溶液，經0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取紅花藥材S1粉末（過3號篩）約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，精密量取續濾液30 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液（15→37）10 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，經0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.5、3.5、4.0、5.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”色譜條件進行分析。以對照品進樣量（?g）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，計算羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素的線性范圍，結果見表1。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，測定峰面積。計算得羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素峰面積的RSD依次為0.57%、0.47%、0.68%、0.52%，結果表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密稱取紅花藥材樣品（S1）1份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，測定峰面積，計算得羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素峰面積的RSD分別為2.45%、1.69%、1.75%、2.37%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取紅花藥材樣品（S1），按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定并計算。羥基紅花黃色素A平均含量為5.68 mg，RSD=1.07%；蘆丁平均含量為1.96 mg，RSD=0.90%；槲皮素平均含量各0.20 mg，RSD=1.31%；山柰素平均含量為0.39 mg，RSD=0.74%。結果表明本方法重復性良好。

2.8 耐用性試驗

將供試品溶液用不同的色譜柱（WondaSil C18 Superb色譜柱、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱和Diamonsil C18色譜柱）及不同的儀器（Agilent 1220 LC和Waters 2690-2487型高效液相色譜儀）進行測定，其他條件均保持一致。結果表明，不同色譜柱和儀器都能將紅花藥材中的4種化學成分依次分離。

2.9 加樣回收率試驗

稱取6份已知含量的同一批紅花藥材S1粉末（過3號篩），每份約0.75 g，分別精密加入一定量的羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定含量，計算回收率，結果見表2～表5。

2.10 樣品含量測定

取6批新疆不同產地的紅花藥材，按“2.3”項下方法制備，在“2.1”項色譜條件下測定其峰面積，分別代入線性回歸方程，計算羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素4種成分的含量，結果見表6。endprint

3 討論

在提取方法和溶劑選擇上，根據2015年版《中華人民共和國藥典》[10]，本研究分別采用25%甲醇直接超聲提取及100%甲醇回流提取，鹽酸酸化后再進行回流提取，結果表明，在相同色譜條件下，后者色譜峰較多，分離度較好。因此，選擇100%甲醇回流提取后鹽酸調節再進行回流提取的方法。

在波長的確定上，本研究參考相關文獻[11-12]，結合指標成分的結構特征，采用DAD檢測器，分別得到各特征峰的紫外光譜圖，對4種混合對照品和紅花樣品進行分析，發現羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素在360 nm處均有吸收，各峰峰形良好，綜合考慮確定檢測波長為360 nm。

紅花主要成分為黃酮類化合物，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑。在流動相的選擇上，參考相關文獻[11-12]，分別采用不同比例甲醇-0.5%磷酸、乙腈-0.5%磷酸和甲醇-乙腈-0.7%磷酸進行等度和梯度洗脫。結果表明，以甲醇-0.5%磷酸為流動相進行梯度洗脫，各化合物的保留時間幅度小且分離效果良好。故本研究選擇甲醇-水作為流動相。

本試驗采用HPLC-DAD同時對紅花藥材中羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素4種化學成分的含量進行測定，保留時間分別在5、13、27、39 min左右。該方法操作簡單、靈敏度高、重復性好，分離度>1.5，實現了紅花藥材中不同類型成分的同時測定，為更好地控制紅花藥材質量及進一步研究提供了依據。

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