甘蔗線條花葉病毒HC-Pro基因的分子變異分析

賀 振, 李文鳳, 張志想, 李世訪*

(1. 揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009; 2. 中國農業科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193; 3. 云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠 661699)

研究報告

甘蔗線條花葉病毒HC-Pro基因的分子變異分析

賀 振1,2, 李文鳳3, 張志想2, 李世訪2*

(1. 揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009; 2. 中國農業科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193; 3. 云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠 661699)

為了解析甘蔗線條花葉病毒Sugarcanestreakmosaicvirus(SCSMV)不同分離物HC-Pro基因的分子變異規律,本研究利用RT-PCR法擴增獲得SCSMV HC-Pro基因的序列,通過生物信息學分析,分別從重組、系統發生、選擇壓力等方面研究SCSMV HC-Pro基因的分子變異特征。共測定了44條SCSMV HC-Pro基因序列,相似性最低值為70%;HC-Pro基因重組頻率較低,僅發現3個重組位點,其中一個系首次報道;與先前報道相比,部分新測定云南蔗區的SCSMV分離物在HC-Pro基因上形成一個新組-第Ⅲ組;HC-Pro基因處于很強的負選擇壓力作用,未發現正向選擇作用位點。本研究結果進一步證明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遺傳多樣性。

甘蔗線條花葉病毒; HC-Pro基因; 分子變異

甘蔗線條花葉病毒Sugarcanestreakmosaicvirus(SCSMV)是近年來從甘蔗花葉病株上鑒定出的一種新病原,屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae禾本科病毒屬Poacevirus[1-2]。該病毒分子量大小約為10 kb,編碼一個多聚蛋白,經水解酶切割后可產生10個成熟的蛋白質,在P3蛋白氨基端有一個PIPO蛋白[2-3]。自然條件下,該病毒可侵染甘蔗和高粱,目前尚未發現SCSMV的傳毒介體[1-3]。2012年,我們在云南省甘蔗產區首次發現該病毒,經調查發現,SCSMV在云南省甘蔗主產區發生越來越普遍,部分地區呈現流行暴發趨勢[1, 4-5]。因此設計合理的SCSMV防治策略對于抑制其在中國蔗區傳播流行具有十分重要的意義。RNA病毒的分子進化研究有利于我們加深對于病毒傳播途徑、流行路線以及寄主相互適應方式等[6-7]的研究,從而為設計合理的病毒病害防治策略提供依據。目前,針對SCSMV的研究較少。Viswanathan等[8]和Bagyalakshmi等[9]發現SCSMV印度分離物存在較高的遺傳多樣性。我們的前期研究發現SCSMV具有一個典型的“準種”結構,普遍存在同種病毒不同分離物或株系混合侵染的現象[5];SCSMV依據不同基因可劃分為9個組(第Ⅰ～第Ⅸ組),并且存在重組現象[5]。不同于Potyvirus,HC-Pro基因是SCSMV基因組中遺傳多樣性最高的一個基因[5],前期研究中由于基因序列的限制,無法對其進行一個系統的分子進化分析,因此,本研究試圖選取不同地區的多個典型分離物,在重組、系統發生、選擇壓力等方面,對其進行系統全面的分子進化分析。

1 材料與方法

1.1 病毒分離物

2009-2012年間從云南省7個甘蔗主產區和國家甘蔗種質資源圃內采集到具有典型花葉癥狀(圖1)的甘蔗樣品324份。新鮮葉片樣品經RT-PCR法檢測鑒定,將SCSMV陽性樣品冷凍干燥后,-80℃保存備用。本研究中所用樣品詳細信息見表1。

1.2 克隆測序

根據GenBank已公布的SCSMV序列保守區,設計用于擴增HC-Pro基因的引物SCSM-HC-Pro-F (5′-TGGACTCATTTGACGCCAGG-3′)和SCSM-HC-Pro-R(5′-CGCTAACCTTGTTGTGTCGT-3′),預期擴增的目的片段大小約為1 500 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

采用TRIzol試劑法提取SCSMV甘蔗葉片中的總RNA,提取方法參照試劑盒說明書進行。取2 μL總RNA,采用Promega公司MLV反轉錄試劑盒,用反向引物SCSM-HC-Pro-R進行反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR。PCR擴增采用50 μL反應體系:10×PCR buffer 5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL,SCSM-HC-Pro-F (10 μmol/L) 2 μL,SCSM-HC-Pro-R (10 μmol/L) 2 μL,ddH2O 34.5 μL,longTaqpolymerase (5 U/μL) 0.5 μL,cDNA 2 μL。PCR反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃復性30 s,72℃延伸1 min,共30個循環;最后一輪循環后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR反應結束后,吸取產物2 μL進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化后克隆至pGEM-T載體上,并轉化至大腸桿菌Escherichiacoli感受態細胞DH5α中。經菌落PCR鑒定獲得陽性重組質粒,將篩選獲得的陽性克隆隨機選擇3～6個送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結果首先通過峰圖及序列比對分析排除由PCR擴增引起的突變,然后通過Bioedit 5.0.9拼接完成。

1.3 重組分析

本研究中,經測序所得SCSMV HC-Pro基因的核苷酸序列共44條(GenBank登錄號分別為:KU314329～KU314372),BLAST檢索結果顯示其與麥類花葉病毒Triticummosaicvirus(TriMV)具有最近的親緣關系。因此,本研究選擇TriMV分離物(NC012779)對應的HC-Pro基因序列作為序列比對分析的外組(outgroup)[10]。結合GenBank中所有可用的SCSMV HC-Pro基因的核酸序列形成一個具有106條序列的數據集合。對該數據集合進行比對,過程如下:首先將核酸序列數據對應的氨基酸序列應用CLUSTRAL X2[11]和TRANSALIGN(由Georg Weiller教授惠贈)比對,以保證經過序列比對后得到的核酸序列能夠正確地編譯出氨基酸序列。經過序列比對后,得到的刪除gap后的HC-Pro基因的序列長度為990個核苷酸(nucleotide,nt)。對比對所得序列數據,利用Datamonkey(http:∥www.datamonkey.org/)中GARD和RDP 4.0軟件包[12-13]中的RDP[12]、GENECONV[14]、BOOTSCAN[15]、MAXCHI[16]、CHIMAERA[17]、3SEQ[18]和SISCAN[19]7個程序進行重組檢測,以發現可能存在的重組位點。在RDP 4.0檢測時,各軟件參數采用默認值,Bonferroni校正的P為0.05或者0.01,當某分離物有至少3個軟件的檢測結果P<1.0×10-6時,支持該分離物為重組體[20-21]。在這些分析中,重組體序列會與非重組體序列存在部分相似,為了方便說明,我們將此非重組體作為該重組體的“親本分離物”(parental isolates),據此,當重組體與親本分離物位于同一組時,將此重組體命名為組內重組體(intralineage recombinant);當重組體與親本分離物位于非同一組時,則命名為組間重組體(interlineage recombinant)[20, 22]。最后,將SCSMV序列數據中外組TriMV序列刪除,去除TriMV對SCSMV序列造成的gap影響,直接檢測確認SCSMV的HC-Pro基因區的重組位點。

表1 本研究中的SCSMV樣品采集信息

Table 1 Information ofSugarcanestreakmosaicvirussamples in this study

分離物名稱Isolate樣品來源Origin采集時間/年-月-日Collectiontime品種Cultivar癥狀SymptomGN12中國開遠Kaiyuan,China2011-06-05Yunzhe91-16花葉MosaicGN34中國開遠Kaiyuan,China2011-06-05F176花葉MosaicW4古巴Cuba2010-05-17MY55-14線條花葉StreakmosaicW14法國France2010-05-17FR93-635花葉MosaicW17印度尼西亞Indonesia2010-08-26POJ2878花葉MosaicW18留尼汪Reunion2010-08-26R570線條花葉StreakmosaicW32美國America2011-06-05CP85-1308花葉MosaicW69巴西Brazil2011-06-05SP71-6180花葉MosaicW75澳大利亞Australia2011-06-05Q71花葉MosaicW76日本Japan2011-06-05RK88-188花葉MosaicM55中國常寧Changning,China2008-06-15Q170線條花葉StreakmosaicM61中國沅江Yuanjiang,China2008-11-15Unknown花葉MosaicM62中國新平Xinping,China2009-07-15Yunyin10花葉MosaicM71中國沅江Yuanjiang,China2009-08-12Badila線條花葉StreakmosaicM85中國紅河Honghe,China2010-08-10Yue79-177花葉MosaicM86中國彌勒Mile,China2010-08-20Yun99-91花葉MosaicM111中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03ROC22花葉MosaicM112中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03ROC22花葉MosaicM113中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yue60花葉MosaicM114中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin3花葉MosaicM115中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin3花葉MosaicM116中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yun03-258花葉MosaicM117中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yun98-136花葉MosaicM118中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03De03-83花葉MosaicM119中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin58花葉MosaicM121中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin58花葉MosaicM124中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03SP81-3250花葉MosaicM126中國沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yun07-912花葉Mosaic

1.4 系統發生分析

對上述處理后的序列分別利用PhyML 3.0[23]中的最大似然法(maximum-likelihood,ML)、MEGA 6.0[24]中的鄰接法(neighbour-joining,NJ)以及SPLITSTREE 4.11.3[25]中的鄰接網法(neighbor-net,NN)進行系統發生分析。在ML法分析中,通過jModeltest 0.1.1[26]分析確定HC-Pro數據的最適核苷酸替代模型為GTR+I+Г4。在ML和NJ法分析中,支長皆用自舉法(bootstrap)進行1 000次模擬復制計算檢驗。系統發育樹由TREEVIEW[27]展示。核酸和氨基酸相似性分析分別依據Kimura two-parameter method[28]和Dayhoff PAM 001matrix[29]方法計算,種群內多樣性分析由MEGA 6.0[24]計算。在本研究中,通過計算HC-Pro基因的dN/dS值(非同義突變和同義突變之間的比值)來預測該基因所承受的選擇壓力。計算基于ML法,通過以下兩種方法進行檢測。首先,利用Datamonkey(http:∥www.datamonkey.org/)中SLAC(single-likelihood ancestor counting)、FEL(fixed-effects likelihood)和REL(random-effects likelihood)在線檢測不同位置密碼子的選擇壓力;第二,在MEGA 6.0[24]中利用Pamilo-Bianchi-Li method[30]計算系統樹不同分支上密碼子的選擇壓力。當dN/dS<1時,該組分離物處于純化或負向選擇壓力下;當dN/dS=1時,說明該組分離物處于中性選擇壓力中;當dN/dS>1時,說明該組分離物受正向選擇或多樣化選擇作用。

1.5 多樣性分析

利用DnaSP 5.0[31]估測不同種群分離物的核酸多樣性(nucleotide diversity)和單體型多樣性(haplotype diversity)。核酸多樣性是指分離物序列間的平均差異;單體型多樣性是指樣本中單體型出現的頻率和數量。一般而言,植物RNA病毒種群的單體型多樣性的值較高,核酸多樣性的值較低[5, 22, 32-35]。SCSMV的HC-Pro基因的核酸和氨基酸間的多樣性分布圖可通過SDT 1.0[36]中的Clustal W[11]法計算獲得。

2 結果分析

2.1 SCSMV HC-Pro基因的序列分析

2009-2012年對云南7個甘蔗主產地州和國家甘蔗種質資源圃內甘蔗花葉病中SCSMV的發生情況進行了調查分析,結果發現:SCSMV在云南省甘蔗種植區平均發病率30%(96個陽性樣品);在甘蔗產區,SCSMV在沅江、開遠、新平、常寧、紅河和彌勒等縣區分布較為廣泛[4];在資源圃內,部分品種的甘蔗種質中SCSMV具有較高的檢出率(59.1%)。

在SCSMV陽性樣品中,選取28個具有典型花葉、線條花葉癥狀(圖1)的樣品,對其HC-Pro基因克隆測序。測序結果顯示,每個樣品中所得不同克隆的序列相似性很高,選取其中差異性較大的序列(44條)登錄到GenBank數據庫中。去掉引物序列,本研究所獲得的HC-Pro基因區段序列長度為1 002 nt。在SCSMV的HC-Pro基因中,并沒有發現在馬鈴薯Y病毒屬病毒的HC-Pro基因中廣泛存在的KITC、GE、FRNK和PTK等結構域。

圖1 甘蔗花葉病癥狀Fig.1 Symptoms of the sugarcane mosaic disease

2.2 重組分析結果

將本研究所測定的以及在GenBank中獲取的共計105個SCSMV HC-Pro基因序列進行重組分析。在利用NN法構建的網狀樹中,部分分離物之間存在明顯的序列交叉,表明部分SCSMV分離物在HC-Pro基因中存在明顯的重組現象(數據未顯示)。利用RDP 4.0[13]分析發現,在HC-Pro基因中共有3個明顯的重組位點,分別位于SCSMV基因組(位點依據SCSMV-ID分離物,登錄號: JF488066)的第1 575、1 736和2 273位點,其中,前兩個位點在先前的研究中有過報道,2 273位點是本研究中新發現的一個重組位點(表 2)。在105個SCSMV序列中,共發現4個明顯的重組體,分別為M117-CL2、M117-CL3、M117-CL7和CB419。本研究所獲得的SCSMV序列中沒有發現明顯的重組位點。

表2 在SCSMV的HC-Pro基因上發生的重組事件1)

Table 2 Recombination event in the HC-Pro gene of SCSMV

重組體Recombinant親本Parent(Major×Minor)重組位點Recombinationsite不同檢測方法的P值P-valuetestedbydifferentmethodsRDPGENECONVBOOTSCANMAXCHICHIMAERASISCAN3SEQM117-CL2M126-CL1×M115-CL61575～22734.120×10-274.070×10-25-1.185×10-171.647×10-81.417×10-305.674×10-49M117-CL7M126-CL1×M115-CL61575～22734.120×10-274.070×10-25-1.185×10-171.647×10-81.417×10-305.674×10-49M117-CL3M126-CL1×M115-CL61575～22731.515×10-212.739×10-27-8.297×10-181.647×10-85.937×10-332.244×10-55CB419CBBaragua×CB08-041736～22731.771×10-41.128×10-2-1.339×10-81.723×10-12.599×10-78.918×10-12

1) 核苷酸位點依據SCSMV-ID分離物(GenBank登錄號: JF488066)。 Regions and sites in accordance to the SCSMV ID isolates (GenBank accession no. JF488066).

圖2 利用ML法對SCSMV HC-Pro基因的系統發生分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the helper-component proteinase (HC-Pro) gene sequences ofSugarcane streak mosaic virus using ML method

2.3 系統發育分析

將上述數據集合去掉重組體,對剩余的SCSMV序列進行系統發生分析,ML法和NJ法構建的系統發育樹具有相似的拓撲結構,ML樹如圖2所示。在先前的報道[5]中,SCSMV依據不同基因至少可分為9個組(第I～第IX組),而依據HC-Pro基因包含第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和第Ⅰ+Ⅳ組。在本研究中,所有分離物共分為4個組,分別為第Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和第Ⅰ+Ⅳ+Ⅶ組,其中第Ⅴ組又可以分為4個亞組(Ⅴ-1、Ⅴ-2、Ⅴ-3和Ⅴ-4)。SCSMV不同地區具有較為明顯的地理特異性,其中中國分離物主要集中在第Ⅲ和第Ⅴ組,而印度分離物主要集中在第Ⅵ和第Ⅰ+Ⅳ+Ⅶ組。本研究所得的SCSMV分離物在系統樹中廣泛分布,且部分來自于云南甘蔗產區的樣品形成一個新組-第Ⅲ組。SCSMV在HC-Pro基因的dN/dS為0.21,沒有發現正向選擇作用位點;不同種群間的dN/dS值遠小于1,其中第Ⅲ組具有最小的dN/dS值(0.036),說明SCSMV不同種群都處于較強的負選擇壓力作用下。

2.4 多樣性分析結果

利用SDT 1.0[36]統計計算SCSMV在HC-Pro基因上的核苷酸多樣性分布,結果如圖3所示。所有SCSMV分離物序列在HC-Pro基因上的核苷酸多樣性程度很高,相似性值低至70%(圖3)。在系統發生所分的4個組中,第Ⅲ組具有較高的單體型多樣性(0.982±0.022)和最低的核苷酸多樣性(0.011 21±0.001 25)(表3)。相對于SCSMV印度分離物,在中國SCSMV不同分離物間遺傳相似性程度更高(表3)。

圖3 SCSMV HC-Pro基因序列一致率分布圖Fig.3 Distribution of pairwise identity scores of the helper-component proteinase (HC-Pro) gene ofSugarcane streak mosaic virus

分組Group數目No.單體型多樣性H核苷酸多樣性ΠⅢ190.982±0.0220.01121±0.00125Ⅰ+Ⅳ+Ⅶ140.989±0.0310.11204±0.01432Ⅴ670.987±0.0070.02499±0.00059Ⅵ1NDND中國China860.991±0.0040.10489±0.01043印度India130.987±0.0350.16323±0.02332

1)Π: 依據序列樣本中堿基間的平均差異計算。ND: 未測定。Π: Nucleotide diversity was estimated by the average pairwise difference between sequences in a sample, based on all sites. ND: Not detected.

3 結論與討論

目前,已經報道了多種植物病毒分子進化與種群結構的研究,特別是Potyvirus,包括PVY[33, 37-38]、TuMV[20, 22]以及TVBMV[35]等。我們先前對SCSMV的分子進化研究發現,HC-Pro基因是其基因組中遺傳多樣性最高的基因,但限于分離物數量有限,未能作充分的研究[5]。在本研究中,我們從云南省甘蔗產區以及國家甘蔗種質資源圃內選擇了28個具有典型甘蔗花葉癥狀的樣品,測定了其HC-Pro基因序列,結合GenBank中已報道的序列信息,對其進行系統的分子變異與種群特征分析。植物病毒在每個單獨的寄主中,是以一個“突變云”或者“準種”[39]方式存在的。因此,經單斑分離獲得單一純化的生物克隆是進行分子變異和種群結構分析的必要條件。而在部分植物病毒中,由于沒有單斑寄主,無法排除不同基因組片段間錯誤拼接的可能,因此通常集中于分析病毒的某些單一擴增片段[4-5]。在本研究中,我們通過單一擴增SCSMV的HC-Pro基因,測定不同克隆序列的方式進行分析,以確保不存在可能的拼接錯誤。

重組是遺傳多樣性的重要來源,是促進病毒進化的主要動力之一。在PVY[32]和TuMV[20, 22]等Potyvirus中,HC-Pro基因的重組發生頻率很高。而在本研究中,SCSMV的HC-Pro基因中僅發現3個重組位點,這表明SCSMV HC-Pro基因中發生重組的頻率很低。He等[5]的研究中,由于分離物的數量限制,SCSMV依據HC-Pro基因可分為4個組,分別為第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和第Ⅰ+Ⅳ組。本研究中測定的部分源自云南蔗區的分離物序列形成一個新組,對照SCSMV P1基因的系統樹,將其定名為第Ⅲ組。第Ⅲ組SCSMV分離物的發現,增加了HC-Pro基因與P1和CP基因在系統發生分析上的一致性。SCSMV不同組間具有清晰的地理特異性,中國分離物主要集中在第Ⅲ組和第Ⅴ組。本研究測定的SCSMV資源圃和甘蔗產區分離物位于不同分支,遺傳差異較大,具有很明顯的亞組結構,這表明云南甘蔗產區和資源圃內SCSMV可能具有不同的起源。通常,大部分的動植物病毒處于強的負選擇壓力下。本研究中,HC-Pro基因的dN/dS遠小于1,表明SCSMV在此基因上受到強的負選擇壓力作用,這可能是與其基因功能的穩定性相適應的。核苷酸多樣性分布結果與系統發生結果相一致,進一步證明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遺傳多樣性,而該結果可能與其功能相適應,盡管目前尚不明確SCSMV HC-Pro的基因功能。

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(責任編輯：田 喆)

Molecular variation of HC-Pro gene ofSugarcanestreakmosaicvirus

He Zhen1,2, Li Wenfeng3, Zhang Zhixiang2, Li Shifang2

(1.SchoolofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 3.YunnanKeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement,SugarcaneResearchInstitute,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kaiyuan661600,China)

The objective of this study is to assess the molecular evolution and divergence of SCSMV according to HC-Pro gene sequences. The HC-Pro gene sequences of SCSMV were obtained by RT-PCR, and analyzed by bioinformatic software, in aspect of recombination, phylogenetics, selection, demography, and gene flow. In the present study, 44 HC-Pro gene sequences were determined with a 70% lowest similarity; only one novel recombination site together with two previous reported sites were found in HC-Pro gene, suggesting that infrequent recombination events were distributed in this gene of SCSMV; one novel lineage (lineage Ⅲ) clustered by SCSMV sequences determined here was found; strong purifying selection was found in the HC-Pro gene of SCSMV. Our genetic study further indicates that the HC-Pro gene showed high genetic diversity in the genome of SCSMV.

Sugarcanestreakmosaicvirus; HC-Pro; molecular variation

2016-03-30

2016-04-23

植物病蟲害生物學國家重點實驗室開放課題(SKLOF201518);揚州大學科技創新培育基金(2015CXJ043)

S 435.661

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.005

Research Reports

* 通信作者 E-mail: sfli@ippcaas.cn