蒙氏假單胞菌3A菌株對煙草漂浮育苗中TMV的鈍化效果

袁蓮蓮, 王耀鋒, 劉相甫, 靳志偉, 張 靜, 李 偉,董石飛, 趙存孝, 黃明迪, 王鳳龍, 楊金廣*

(1.中國農業科學院煙草研究所,國家煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室, 青島 266101;2. 甘肅省煙草公司慶陽市公司, 慶陽 745000; 3. 中國煙葉公司, 北京 100055; 4. 甘肅省煙草公司, 蘭州 741306;5. 紅云紅河煙草(集團)有限責任公司, 昆明 650231; 6. 甘肅省煙草公司隴南市公司, 隴南 746000)

蒙氏假單胞菌3A菌株對煙草漂浮育苗中TMV的鈍化效果

袁蓮蓮1, 王耀鋒2, 劉相甫3, 靳志偉4, 張 靜5, 李 偉5,董石飛5, 趙存孝2, 黃明迪6, 王鳳龍1, 楊金廣1*

(1.中國農業科學院煙草研究所,國家煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室, 青島 266101;2. 甘肅省煙草公司慶陽市公司, 慶陽 745000; 3. 中國煙葉公司, 北京 100055; 4. 甘肅省煙草公司, 蘭州 741306;5. 紅云紅河煙草(集團)有限責任公司, 昆明 650231; 6. 甘肅省煙草公司隴南市公司, 隴南 746000)

選用對煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)具有顯著拮抗活性的蒙氏假單胞菌Pseudomonasmonteilii3A菌株對煙草漂浮育苗過程中被TMV污染的育苗棚、育苗盤、基質及剪葉機械等進行生物鈍化,并利用real-time RT-PCR對污染基質中TMV的含量進行了定量檢測。結果顯示,200、400倍及600倍P.monteilii3A菌懸液稀釋液均可顯著鈍化病苗殘留干葉及干根中的TMV;剪葉機械經不同稀釋倍數的P.monteilii3A菌懸液處理后,在一定程度上抑制了TMV的發生,相對防效達51.42%～100%;基質經不同稀釋倍數的P.monteilii3A菌懸液處理后,其中TMV的含量也下降了72.73%～88.46%,對TMV的相對防效達61.56%～87.46%。其中,200倍P.monteilii3A稀釋液處理育苗棚、育苗盤20 min以上,浸泡剪葉機械1 min以上對TMV鈍化效果最好。

煙草普通花葉病毒(TMV); 蒙氏假單胞菌3A菌株; 漂浮育苗

煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)引起的病毒病可嚴重危害農作物的正常生長。TMV在農作物上主要通過農事操作進行傳播,煙草育苗過程中被TMV污染的育苗棚、育苗盤、基質及剪葉機械等是TMV的重要初侵染源[1]。由于TMV擁有較高的侵染稀釋限點,極微量的病毒粒體就可以傳播,且TMV的抗逆性較強,其病毒粒體在基質中殘留10年仍具有較強的侵染活性[2-3];此外,生產上常用的育苗盤一般多孔,不易進行清洗和消毒,且經常會有一些煙苗殘體黏附在苗盤上,TMV可在干的煙苗殘體中存活數年[4];再者,煙草育苗期需進行多次剪葉,且育苗集中度高,一旦存在毒源則容易大面積傳播[5]。為了能夠更有效地控制TMV侵染帶來的危害,應從根本上減少其初侵染源,切斷其傳播途徑[6]。近些年,實際生產中主要通過噴施抗病毒藥劑對TMV進行防治,但效果并不理想,且存在著嚴重的農藥殘留問題,導致農作物和環境被嚴重污染。1925年,有研究發現被細菌污染的植物病毒提取液喪失了侵染能力,這為利用微生物及其代謝產物防治植物病毒病提供了新的思路[7]。微生物農藥為無公害生物制劑,具有安全可靠、對環境友好等優點,應用其防治TMV可避免環境污染和農藥殘留[8]。因此,篩選有效、安全的生物制劑對煙草育苗過程中TMV的防控具有重要意義。

研究者曾對育苗過程中剪葉機械的消毒劑進行了篩選[9-11],分析了蒸汽、部分藥劑對舊漂浮盤殘留物中TMV的鈍化效果[11-12],但少有噴施有效的生物制劑鈍化育苗棚、育苗盤中病苗殘留物(根、葉)、基質及剪葉機械中TMV的研究報道,而生物制劑如能同時用于育苗棚、苗盤、基質及剪葉機械等鈍化TMV,在實際生產上將更為經濟方便。結合實際生產情況,本研究選用對TMV具有較強拮抗活性的蒙氏假單胞菌Pseudomonasmonteilii3A菌液噴施于育苗棚、剪葉機械、基質及育苗盤,比較幾種常用濃度菌液鈍化TMV的效果,以期為煙草育苗過程中鈍化TMV的生物制劑的選擇和科學使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為‘NC89’,在中國農業科學院煙草研究所試驗基地培育至4～6葉期健康煙苗供試。TMV毒源系及P.monteilii3A菌株均由中國農業科學院煙草研究所分離純化和鑒定,TMV經過枯斑寄主三生煙單斑分離3次后接種于‘NC89’幼苗上,于25～28℃防蟲條件下保存備用,P.monteilii3A在-70℃條件下于甘油中保存。抗TMV藥劑對照為8%寧南霉素水劑,由德強生物股份有限公司提供。

1.2 蒙氏假單胞菌3A菌液對TMV體外抑制效果測定

將甘油中保存的P.monteilii3A菌株,在LB固體培養基上畫線培養,挑取單菌落接種于3 mL LB液體培養基中,于28℃擴大培養48 h,取純化好的菌株涂片,進行革蘭氏染色及運動力檢測。純化好的菌株進行生理生化測定,經菌株鑒定為P.monteilii3A后,以1∶100比例接種于LB液體培養基中,進行大規模發酵培養,最后用無菌水稀釋成1×108cfu/mL作為菌液備用。

利用局部枯斑法測定P.monteilii3A菌液對TMV的抑制效果[13]。稱取2 g新鮮TMV病葉加100 mL 滅菌磷酸緩沖液研磨成勻漿,用滅菌紗布過濾后取上清液作為接種液;P.monteilii3A菌液用無菌水稀釋200、400倍和600倍。分別將不同濃度的3A菌液稀釋液與TMV接種液等量混合,室溫下分別靜置10、20 min后摩擦接種,接種前葉片表面噴灑適量金剛砂。左半葉接種磷酸緩沖液處理的TMV接種液(對照),右半葉接種P.monteilii3A菌液與TMV接種液的混合液,每半片葉接種200 μL。接種后用清水進行葉面沖洗,3次重復。接種3 d左右后進行枯斑數統計,并計算抑制率。

抑制率(%)=[1-(處理平均枯斑數/對照平均枯斑數)]×100。

1.3 病苗殘留干葉、干根的蒙氏假單胞菌3A菌液浸泡處理

選用稀釋200、400、600倍的P.monteilii3A菌液來模擬舊育苗盤、育苗棚的處理。將感染TMV的煙苗的細干根及干葉放置于燒杯中,分別加入20倍材料體積的不同稀釋倍數的菌液浸泡20 min,倒去菌液,用塑料薄膜密封燒杯口,室溫下放置2 d,隨后加入20倍材料體積的去離子水研磨,過濾后取上清液進行接種;以LB液體培養液浸泡感病組織作為對照。采用局部枯斑法測定,接種3 d后統計枯斑數。

1.4 蒙氏假單胞菌3A菌液對TMV污染剪葉機械的浸泡處理

取新鮮TMV病葉3～5片,用剪刀反復多次剪切病葉,然后將感染TMV的剪刀分別在稀釋200、400、600倍的P.monteilii3A菌液中浸泡10 s、1 min和5 min,清水沖洗后剪葉,另設清水對照。每個處理6株煙苗,每株剪3片煙葉,重復3次,剪葉后每個處理分開單獨培養。30 d后統計發病率、病情指數。

發病率(%)=100×發病株數/調查總株數;

病情指數=100×(∑各級病株數×該病級值)/(調查總株數×最高級值);

控制效果(%)=100×(對照區病情指數-處理區病情指數)/對照區病情指數。

1.5 蒙氏假單胞菌3A菌液對TMV污染基質中TMV的鈍化效果

10 g 新鮮TMV病葉加100 mL 磷酸緩沖液研磨成勻漿,按照1∶5 (mL/g)比例澆灌基質。然后用不同濃度的3A菌液分別按照1∶5 (mL/g)比例處理病毒汁液澆灌過的基質,室溫靜置15 d,以此基質種植4葉期‘NC89’幼苗。以0.16 μg/mL寧南霉素水劑按照1∶5(mL/g)比例處理病毒汁液澆灌過的基質為藥劑對照,無菌水處理為空白對照。30 d后統計發病率、病情指數,并再采集各處理的基質利用real-time RT-PCR測定其TMV相對含量。

1.6 Real-time RT-PCR

采集被TMV污染的基質,依據McGrath等的方法進行離心處理[14],后利用PowerSoilTM RNA Extraction Kit (MoBio, USA)進行總RNA提取,提取方法參照試劑和說明書進行操作,每個樣品進行3次重復提取。

參考試劑盒說明書合成cDNA,利用PerlPrimer軟件設計TMV的特異性引物,引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成,煙草內參基因qActinF:5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′;qActinR:5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′;qTMV5:5′-ATTAGACCCGCTAGTCACAGCAC-3′,qTMV3:5′-GTGGGGTTCGCCTGATTTT-3′[15]。根據SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect real time)的說明書設定PCR反應體系及條件,設置5個cDNA濃度梯度,10、102、103、104、105,每個梯度各3次重復,利用 ABI 7500 Real-Time PCR system (ABI,USA)自帶的SDS軟件進行數據分析,生成標準曲線方程。同時,通過Real-Time PCR檢測TMV基因的積累量[16]。

1.7 數據分析

所得數據均用Excel 2010軟件處理,同時利用SPSS(version 14.0)統計軟件中單樣本t-test對不同處理的差異顯著性進行分析。

2 結果分析

2.1 蒙氏假單胞菌3A菌液對新鮮病葉中TMV的防控作用

不同稀釋倍數的P.monteilii3A菌液與TMV接種液等量混合并分別靜置10 min、20 min后接種‘NC89’,以測試P.monteilii3A對TMV的鈍化效果。從表1中可看出,P.monteilii3A菌液稀釋液對TMV的抑制率與混合后靜置的時間呈正相關,混合液靜置10 min后進行接種,其200、400、600倍稀釋液對TMV的抑制率分別為100.00%、76.34%、72.68%;混合液靜置20 min后接種,對TMV的抑制率分別為100.00%、82.77%、77.43%,表明P.monteilii3A菌液可顯著鈍化新鮮病葉中的TMV,鈍化效率高達72.68%～100.00%,對TMV的鈍化效果隨混合液靜置時間的延長而增強,但均隨菌液濃度的降低而下降,采用200倍P.monteilii3A菌液,與TMV接種液的接觸時間不少于10 min時抑制效果最佳。

2.2 蒙氏假單胞菌3A菌株對病苗殘留干葉、干根中TMV的鈍化作用

選用稀釋200、400、600倍的P.monteilii3A菌液浸泡感染TMV的煙苗殘留干葉及干根后接種健康煙苗測定P.monteilii3A菌液對TMV的鈍化作用。結果表明,以LB液體培養基浸泡后的感病組織作為毒源接種健康煙苗,接種葉片上出現較多枯斑,而經不同倍數P.monteilii3A菌液浸泡后的感病組織浸提液接種的葉片枯斑數量較少或者沒有。表明不同濃度的P.monteilii3A菌液均可顯著鈍化病苗殘留干葉及干根中的TMV,200倍P.monteilii3A菌液的鈍化效果最佳。

表1 不同濃度蒙氏假單胞菌3A菌液對新鮮病葉中TMV的鈍化效果

Table 1 Prevention effects ofPseudomonasmonteilii3A bacterial liquid on TMV in fresh tobacco diseased leaves

處理Treatment稀釋倍數/倍Dilutionmultiple接觸10min的枯斑數/個No.oflocalnecroticlesionsaftercontactfor10min對照CK處理Treatment抑制率/%Inhibitionrate接觸20min的枯斑數/個No.oflocalnecroticlesionsaftercontactfor20min對照CK處理Treatment抑制率/%Inhibitionrate蒙氏假單胞菌P.monteilii3A20055.300100.0077.300100.0040035.508.4076.3438.306.6082.77600142.4038.9072.68133.8030.2077.43

圖1 不同稀釋倍數的蒙氏假單胞菌3A菌株菌懸液對TMV的鈍化作用Fig.1 Passivation of Pseudomonas monteilii 3A on TMV at different concentrations of bacterial suspension

2.3 蒙氏假單胞菌3A菌株對被污染剪葉機械上TMV的鈍化效果

表2列出了蒙氏假單胞菌3A菌株對被污染剪刀中TMV的鈍化效果。從表中可看出,剪刀經清水浸泡處理的對照,TMV發病率為34%左右,而剪刀經過不同稀釋倍數的P.monteilii3A菌懸液處理后,在一定程度上抑制了煙草普通花葉病的發生,相對防效達51.42%～100%。隨著P.monteilii3A菌懸液處理濃度升高,或處理時間延長,TMV發病率顯著下降,防治效果明顯增加。剪刀經稀釋200倍的P.monteilii3A菌懸液浸泡不少于1 min時對TMV的鈍化效果最好,防治效果達100%。

表2 蒙氏假單胞菌3A菌株對污染剪刀中TMV的鈍化效果1)

Table 2 Passivation effect ofPseudomonasmonteilii3A on TMV in clipping tools

處理Treatment稀釋倍數/倍Dilutionmultiple發病率/%Diseaseincidence10s1min5min相對防效/%Relativecontroleffect10s1min5min蒙氏假單胞菌P.monteilii3A200(7.28±0.04)dA(0.00±0.00)dB(0.00±0.00)dB(77.30±0.07)aB(100.00±0.00)aA(100.00±0.00)aA400(11.24±0.03)cA(5.59±0.07)cB(1.24±0.04)cC(65.43±0.03)bC(86.34±0.02)bB(91.32±0.10)bA600(18.34±0.10)bA(11.56±0.09)bB(4.64±0.09)bC(51.42±0.12)cC(65.24±0.11)cB(88.05±0.12)cA無菌水Sterilewater0(34.24±0.17)aA(34.65±0.10)aA(34.42±0.22)aA---

1) 同行數據后具有不同大寫字母者表示在0.05水平差異顯著;同列數據后具有不同小寫字母者表示在0.05水平差異顯著。 The data in the same row followed by different capital letters are significantly different (P<0.05); the data in the same column followed by different lowercase letters are significantly different (P<0.05).

2.4 蒙氏假單胞菌3A菌株對TMV污染的植煙土壤中TMV的鈍化效果

經AB7500 Real-time PCR system自帶的SDS軟件分析Real-time PCR檢測所得的數據,可生成TMV和Actin基因的標準曲線,經稀釋10～1055個梯度處理的cDNA起始模板量和循環閾值Ct的線性關系曲線。TMV基因的標準曲線方程:y=-3.867 5x+33.5,R2=0.996 0;Actin的標準曲線方程:y=-2.402 1x+30.931,R2=0.9972。R2均達0.98以上,熔解曲線峰單一,無非特異性擴增,定量準確,符合實時熒光定量PCR要求。

表3顯示了蒙氏假單胞菌3A菌株對TMV污染基質中TMV的鈍化效果。可看出,與無菌水處理相比,經不同稀釋倍數P.monteilii3A菌懸液處理后,基質中TMV的含量顯著降低,TMV的發病率也顯著下降,相對防效達61.56%～87.46%。隨著P.monteilii3A菌懸液濃度的升高,TMV發病率顯著下降,防治效果明顯增強,其中,400倍P.monteilii3A菌懸液處理對基質中TMV的鈍化效果與寧南霉素相近,相對防效在75%左右。處理后基質中TMV的含量下降了72.73%～88.46%,表明P.monteilii3A菌懸液可明顯減少植煙基質中TMV的含量。200倍P.monteilii3A菌懸液對TMV的鈍化作用最佳。

表3 蒙氏假單胞菌3A菌株對基質中TMV的鈍化作用1)

Table 3 Passivation effect ofPseudomonasmonteilii3A on TMV in matrix

處理Treatment發病率/%Diseaseincidence相對防效/%Relativecontroleffect基質中TMV拷貝數/個·g-1AmountofTMVinmatrix1∶200P.monteilii3A(7.08±0.01)d(87.46±0.04)a(2864.02±5.02)d1∶400P.monteilii3A(16.26±0.04)c(76.59±0.09)b(4573.12±7.13)c1∶600P.monteilii3A(28.68±0.07)b(61.56±0.08)c(6747.34±8.03)b寧南霉素(陽性對照)Ningnanmycin(positivecontrol)(17.33±0.02)c(74.46±0.14)b(4457.26±7.52)c無菌水(空白對照)Sterilewater(negativecontrol)(53.24±0.10)a-(24745.64±10.82)a

1) 基質中TMV拷貝數為6個采樣點的平均值;同列數據后具有不同小寫字母者表示在0.05水平差異顯著。 The TMV copies in matrix are means of six sampling sites. The data in the same column followed by different lowercase letters are significantly different (P<0.05).

3 討論與結論

煙草生產過程中易受到多種病毒的危害,比較不同病毒的體外保毒期、鈍化溫度、稀釋限點及傳播方式等可看出,TMV抗逆性最強、最易通過育苗過程傳播,且煙苗一旦被TMV侵染,則無法進行有效防治[5]。因此,本研究測定生防菌株蒙氏假單胞菌3A菌株對煙草漂浮育苗中TMV的鈍化效果,通過消滅初侵染源和切斷傳播途徑來進行防治,同時,對生產上利用生物制劑防治煙草漂浮育苗過程中其他病毒具有指導意義。

本研究選用對TMV具有顯著拮抗活性的生防菌株蒙氏假單胞菌3A菌株,對煙草漂浮育苗過程中被TMV污染的育苗棚、育苗盤、基質及剪葉機械等進行生物鈍化,并利用real-time RT-PCR對污染基質中TMV的含量進行了定量檢測。結果顯示,不同倍數P.monteilii3A菌懸液均可顯著鈍化感病煙苗殘留干葉及干根中的TMV;剪葉機械經不同稀釋倍數的P.monteilii3A菌液處理后,在一定程度上可抑制TMV的發生,相對防效達51.42%～100%;基質經不同稀釋倍數的P.monteilii3A菌液處理后,其中TMV的含量也下降了72.73%～88.46%,對TMV的相對防效61.56%～87.46%。總體來說,P.monteilii3A對煙草漂浮育苗中TMV的鈍化效果顯著。

本研究中使用的TMV濃度較高,在實際生產上剪葉機械、苗盤、基質和人為操作等的帶毒濃度遠比試驗濃度低,因此,試驗中確定的最佳濃度和使用時間同樣可應用于實際生產。試驗結果顯示,200倍P.monteilii3A菌液對TMV鈍化效果最好,與育苗棚、育苗盤的接觸時間應不少于20 min,剪葉機械應浸泡1 min以上。與其他化學抗病毒制劑或消毒劑相比,P.monteilii3A菌液主要表現為具有活性的生防菌,安全、持續、無污染和低碳。這就為當前有機無公害生態農產品的生產提供了必要的條件,值得推廣應用。

國內外已有很多有關假單胞菌作為生防菌的研究,結果表明,P.monteilii可以胞外分泌酯酶[17]。徐麗等的研究顯示P.monteilii可作為五味子植株根內生菌抑制五味子莖基腐病菌、穿山龍黑斑病菌及人參銹腐病菌的活性[18]。翟熙倫的研究表明,蒙氏假單胞菌4A1菌株發酵液中的活性物質可破壞TMV粒體,對病毒產生鈍化作用,破壞病毒蛋白亞基之間的作用力,使病毒粒體缺乏完整性,從而無法在寄主體內增殖,降低病毒的侵染能力[19]。本研究的3A菌株為蒙氏假單胞菌,對煙草漂浮育苗中TMV的鈍化效果顯著,對植物病毒病的防治有潛在的應用價值,但是其與TMV在煙草植株內的作用機制還有待進一步深入研究。

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(責任編輯：田 喆)

Passivation effect ofPseudomonasmonteilii3A onTobaccomosaicvirusin tobacco float seedlings

Yuan Lianlian1, Wang Yaofeng2, Liu Xiangfu3, Jin Zhiwei4, Zhang Jing5, Li Wei5,Dong Shifei5, Zhao Cunxiao2, Huang Mingdi6, Wang Fenglong1, Yang Jinguang1

(1.TobaccoResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofTobaccoPestMonitoring,Controlling&IntegratedManagement,Qingdao266101,China; 2.QingyangTobaccoCompany,GansuTobaccoCooperation,Qingyang745000,China; 3.ChinaNationalLeafTobaccoCorporation,Beijing100055,China; 4.GansuTobaccoCooperation,Lanzhou741306,China; 5.HongyunandHongheTobacco(Group)Co.,Ltd.,Kunming650231,China;6.LongnanTobaccoCompany,GansuTobaccoCooperation,Longnan746000,China)

Pseudomonasmonteilii3A strain was selected to evaluate the passivation effect onTobaccomosaicvirus(TMV) in tobacco seedlings by real-time RT-PCR, combined with the incidence and disease index of the virus disease. The results showed thatP.monteilii3A bacterial liquid with different concentration gradients (200, 400 and 600×) had significant passivation effects on TMV in the residual dry roots and leaves of the old seedling sheds and trays. Meanwhile, using the clipping tool treated withP.monteilii3A bacterial liquid could reduce the incidence and disease index of the virus disease, and the relative control effect was 51.42%-100%.P.monteilii3A bacterial liquid could reduce the amount of TMV in the matrix polluted with TMV through bio-passivation by 72.73%-88.46%, and the relative control effect on the virus disease was 61.56%-87.46%. The best dilution ofP.monteilii3A bacterial liquid was 1∶200, and the optimum contact time on old seedling sheds and trays was no less than 20 min. Meanwhile, the clipping tools should be treated more than 1 min.

Tobaccomosaicvirus(TMV);Pseudomonasmonteilii3A; float seedling

2016-03-24

2016-06-07

甘肅省煙草公司科技項目(2015-08)

S 435.72

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.006

* 通信作者 E-mail:jinguangyang@126.com