辣椒輕斑駁病毒湖南分離物的全基因序列測定及結構分析

劉湘寧, 戴良英, 李 魏, 董 錚, 唐前君

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 湖南農業大學病毒研究所, 長沙 410128;3. 湖南省植物病蟲害生物學與防控重點實驗室, 長沙 410128)

辣椒輕斑駁病毒湖南分離物的全基因序列測定及結構分析

劉湘寧1,3, 戴良英1,3, 李 魏1,3, 董 錚1,3, 唐前君1,2,3*

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 湖南農業大學病毒研究所, 長沙 410128;3. 湖南省植物病蟲害生物學與防控重點實驗室, 長沙 410128)

采自湖南地區的辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)樣品經單斑分離后,根據已經報道的PMMoV序列基因保守區設計6對簡并引物,采用片段重疊法和RACE方法擴增、克隆獲得一個全長為6 356 bp的湖南分離物(PMMoV-HN1,登錄號:KP345899)全基因組序列,編碼4個蛋白,分別為126 kD蛋白(70～3 423 nt)、183 kD蛋白(70～4 908 nt)、28 kD蛋白(4 909～5 682 nt)和17.5 kD蛋白(5 685～6 158 nt),5′-非編碼區(5′-UTR)和3′-非編碼區(3′-UTR)分別含有69和198個堿基,其中5′-UTR存在一個序列為m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子結構。一致性分析發現PMMoV-HN1與PMMoV其他分離物的核酸一致性為94%～99%,編碼的氨基酸一致性為94%～99%。全基因組序列系統進化分析表明PMMoV-HN1分離物與中國首次報道的PMMoV-CN分離物親緣關系最近。本研究是國內報道的第二例PMMoV全基因組序列。

辣椒; 辣椒輕斑駁病毒; 全基因序列; 序列分析

辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)是煙草花葉病毒屬Tobamovirus成員,屬于正義單鏈RNA病毒,最早發現于美國,后來在西班牙、德國、澳大利亞、阿根廷、加拿大、英國、巴西等國家和地區均有相關報道,曾對英國、美國的辣椒種植造成毀滅性損失[1]。PMMoV主要侵染茄科辣椒屬植物,植株被侵染后表現斑駁或黃綠相間的花葉癥狀,果實被侵染后畸形、斑駁,可能出現凹凸斑點。PMMoV在辣椒上的種傳率高達22%～29%,是溫室和大棚辣椒病毒病害的重要毒源[2]。PMMoV可通過種子與染毒汁液摩擦傳毒,在植物病株殘體上可存活25年左右,昆蟲介體不易傳毒,帶毒種子、感病植株和帶病土壤是重要的侵染來源[3]。國內于1994年首次在新疆辣椒上發現PMMoV[4]后,陜西、山東青島、北京及寧夏等地區相繼報道了該病毒[5-7]。2006年中國首次分離測定了PMMoV的全基因組序列,命名為PMMoV中國分離物(PMMoV-CN)[8]。2013年,鄭興華等對在貴州各辣椒主產區采集的200多份辣椒病樣進行血清學檢測,發現貴州地區PMMoV的檢出率僅次于黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV),達到22%～29%[9]。魯宇文等[10]首次在我國辣椒田間病毒病樣中檢測到辣椒斑駁病毒Peppermottlevirus(PepMoV)和PMMoV復合侵染。

湖南是我國重要的辣椒產地,主要栽培品種有‘興蔬215’、‘興蔬16號’、‘興蔬301’、‘興蔬嫩辣’、‘湘研15號’、‘湘研16號’、‘博辣嬌紅’、‘博辣紅?！ⅰ├?號’、‘博辣6號’、‘博辣4號’、‘湘辣4號’、‘湘辣7號’等。近年來,辣椒病毒病在辣椒的種植和生產上的危害日益加重,嚴重影響了辣椒的產量和品質,PMMoV是造成辣椒經濟損失的重要病原之一,但目前有關PMMoV的研究非常有限,同時PMMoV對湖南辣椒的侵染鮮有報道。本研究在湖南辣椒病樣中檢測到PMMoV,采用片段重疊法和RACE方法對湖南辣椒上PMMoV-HN1分離物的全基因序列進行測定、序列結構和一致性分析,同時發現PMMoV其他病毒屬病毒存在復合侵染現象,可為PMMoV的發生規律和該分離物后續的功能研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 辣椒樣本采集與保存

2013年6月隨機采取葉片皺縮、畸形、扭曲、斑駁、褪綠,葉片變小、萎蔫,莖稈褪綠,植株矮化等典型病毒病危害癥狀的辣椒樣品196份(具體辣椒品種和采集地點見表1)。經RT-PCR檢測后測序確定為PMMoV侵染的辣椒樣品,在莧色藜上3次單斑分離純化,采集莧色藜單斑葉片保存于-80℃。

表1 樣本來源及數量

Table 1 Sample sources and numbers

品種Variety樣品/份Samplenumber采集地點Collectionsite品種Variety樣品/份Samplenumber采集地點Collectionsite興蔬21543長沙、衡陽博辣6號22長沙、衡陽湘研15號31長沙、衡陽博辣紅牛14株洲湘研16號24長沙興蔬16號10衡陽興蔬30117衡陽博辣5號12長沙興蔬嫩辣12長沙湘辣4號11衡陽

1.1.2 試劑

PMMoV病毒ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司;植物總RNA提取試劑(easyPure Plant RNA Kit)、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成試劑盒、pEASY-TI Cloning Kit、TaqDNA聚合酶和其他常規分子生物學試劑購自北京全式金生物技術有限公司;普通DNA產物純化試劑盒購自北京天根(Tiangen)生化科技有限公司;Smarter RACE 5′/3′ Kit Race試劑盒購自寶生物(TaKaRa)大連公司。

1.2 方法

1.2.1 病葉總RNA的提取及cDNA的合成

取樣品0.5 g置于研缽中,加液氮,充分研磨,按照easyPure Plant RNA Kit試劑盒說明書步驟提取植物總RNA,利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA,-20℃保存。

1.2.2 辣椒樣品PMMoV鑒定

參照黃粵等[6]的方法和特異性檢測引物(CP基因,上游引物:ATTACTACCGCCGATGCTGAG;下游引物:TGGAGGAAAAACACTACGAG)對196份樣品進行RT-PCR檢測,獲得的PCR產物送至生工生物工程(上海)有限公司測序,將測序結果在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行BLAST比對,確定鑒定結果。

1.2.3 PMMoV全基因的克隆、拼接

參照PMMoV-CN(登錄號:AY859497)基因全序列,使用Premier 6.0設計出6對引物(表2),引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。采用片段重疊法克隆PMMoV湖南分離物基因組序列,根據RACE試劑盒說明書克隆獲得PMMoV的5′端與3′序列。

表2 克隆PMMoV湖南分離物基因組的引物序列

Table 2 Primers for cloning PMMoV isolate Hunan

擴增片段Segment引物名稱Primer引物序列Sequence(5'-3')引物位置Location片段長度/bpExpectedproductlengthP1P1-FCGGCGGTAAATTTTTCACAAT 1～211524P1-RAGCAGCAGTAATCTCATCC1527～1545P2P2-FCGCTTACTTACGCCAATG1310～13281570P2-RTCTGTTGATGTAAGGAGTCTG2878～2898P3P3-FGCGACCAAGGAGAATGTAA2740～2759809P3-RTGGTTACAGCATCATACTCA3549～3568P4P4-FCAGCAGACTCCTTACATCA3341～33601110P4-RCGGTAGCATAGAGGACAG4452～4470P5P5-FAAGGTTAGGCTTAGACGATT4290～43111695P5-RTCTCGGCAGTTGTAGGAT5989～6006P6P6-FGGAGTTCATCGAATCAGT5510～5528809P6-RTTCTATCTACCCGCGGTTC6320～6337

PCR產物經純化后與T1載體連接,轉入Trans1-TI感受態細胞后于含100 μg/mL氨芐青霉素的平板上培養過夜,菌液PCR篩選含重組質粒的陽性克隆,并提取質粒DNA送至上海生工生物工程有限公司測序。將測序結果在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行BLAST,鑒定測序的結果。利用DNAstar軟件對上述6對引物擴增所得序列和RACE擴增序列進行拼接。

1.2.4 基因序列分析

采用ORF Finder(open reading frame finder)對所獲得的PMMoV全基因組序列進行基因組結構分析,對PMMoV-HN1的全基因組序列進行BLAST檢索,找到17個PMMoV分離物的全基因序列與7種煙草花葉病毒屬病毒序列,使用DNAMAN 6.0分析25種分離物(含PMMoV-HN1)(表3)的全基因組序列一致性,利用MEGA 5.2 NJ法聚類分析法構建25種分離物(含PMMoV-HN1)全基因組序列系統進化樹,使用1 000次重復的自展檢驗系統評價進化樹拓撲結構的可靠性,其中,序列間進化距離根據Kimura-2參數遺傳距離模型計算[11]。

2 結果與分析

2.1 辣椒樣品PMMoV檢測

對湖南10個主栽品種196份樣品進行RT-PCR檢測,結果發現在這些辣椒主栽品種上PMMoV檢出率為9.1%～29.4%(PMMoV的檢出率見表4),檢測獲得PCR產物(CP基因)經測序比對,其相似度為100%。

表3 本研究中涉及的病毒分離物

Table 3 Viral isolates involved in this study

GenBank登錄號GenBankaccessionno.病毒分離物Isolate來源SourceKP345899PMMoV-HN1中國湖南AB000709PMMoV-J日本AB069853PMMoV-C-1421日本M81413PMMoV-S西班牙AB113116PMMoV-Pa18日本AB113117PMMoV-TPO-2-19日本AY859497PMMoV-CN中國北京KR108207PMMoV-LS韓國KR108206PMMoV-RP韓國AB550911PMMoV-BR-DF01巴西KJ631123PMMoV-HP1印度KU311159PMMoV-PMMVOU2加拿大AB254821PMMoV-Iw日本LC082099PMMoV-P2韓國AB126003PMMoV-Kr韓國AB276030PMMoV-L4BV日本AJ308228PMMoV-Ia西班牙LC082100PMMoV-P3韓國D13438ObPV-Ob日本NC_001728ORSV韓國AB089381PaMMV-Japanese日本D38444TMV-Cg日本NC_001556TMGMV美國NC_002692ToMV-Queensland澳大利亞D63809TMV-Rakkyo日本

表4 湖南辣椒PMMoV檢出率

Table 4 PMMoV detection rate in Hunan

品種Variety樣品/份Samplenumber陽性樣品/份Positivenumber檢出率/%Detectionrate品種Variety樣品/份Samplenumber陽性樣品/份Positivenumber檢出率/%Detectionrate興蔬215431227.9博辣6號22313.6湘研15號31722.6博辣紅牛14321.4湘研16號24520.8興蔬16號10220.0興蔬30117529.4博辣5號12216.7興蔬嫩辣12216.7湘辣4號1119.1

2.2 PMMoV-HN1全基因組結構分析

克隆、測序獲得了PMMoV-HN1(登錄號:KP345899)的全基因組序列全長6 356 bp,PMMoV-HN1的全基因組序列包含1 880個堿基A、1 777個堿基T、1 177個堿基C、1 521個堿基G,這4種堿基在PMMoV-HN1的全基因組中所占百分比依次分別為29.6%、28.0%、18.5%和23.9%。5′-非編碼區(5′-UTR)和3′-非編碼區(3′-UTR)分別含有69和198個堿基,其中5′-UTR存在一個序列為m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子結構,二級結構顯示在該端形成一個發夾結構(圖1)。PMMoV-HN1有4個開放閱讀框架,編碼4個蛋白,分別為126 kD蛋白(70～3 423 nt)、183 kD蛋白(70～4 908 nt)、28 kD蛋白(4 909～5 682 nt)和17.5 kD蛋白(5 685～6 158 nt),其中28 kD蛋白與17.5 kD蛋白由亞基因組RNA表達產生,亞基因組RNA無帽子結構。第一個開放閱讀框編碼的蛋白與病毒復制相關,閱讀框終止于琥珀密碼子UAG,同時第一個開放閱讀框與第二個開放閱讀框共同編碼一個與病毒復制相關的蛋白,第三個開放閱讀框編碼的蛋白與病毒移動有關,第四個開放閱讀框編碼的蛋白為病毒衣殼蛋白。

圖1 PMMoV-HN1的二級結構Fig.1 Possible secondary structure of PMMoV-HN1

2.3 不同來源的PMMoV分離物全基因組序列分析

通過DNAMAN 6.0分析18個不同來源的PMMoV分離物及7個煙草花葉病毒屬的病毒分離物的全序列基因組一致性,結果(表5)表明,PMMov-HN1與同屬異種病毒的一致性僅為46.5%～65.8%,序列差異性明顯;與17種PMMoV病毒分離物的一致性在94.2%～99.7%之間,其中,PMMoV-HN1與日本分離物PMMoV-J的一致性最高(99.7%),與中國分離物PMMoV-CN一致性為99.5%,與韓國分離物PMMoV-P3一致性最低(94.2%)。PMMov-HN1與17種PMMoV分離物的ORF區域氨基酸序列一致性比較結果顯示,其ORF1、ORF2的一致性在98.3%～99.9%,其中與PMMoV-J僅一個氨基酸不同;ORF3的一致性在96.9%～99.6%,ORF4病毒衣殼蛋白區域除了與PMMoV-Ia的一致性為96.8%外,與其他分離物的一致性均高于98%,其中PMMoV-J、PMMoV-C-1421、PMMoV-S、PMMoV-Pa18、PMMoV-TPO-2-19、PMMoV-CN、PMMoV-RP、PMMoV-BR-DF01、PMMoV-HP1、PMMoV-PMMVOU2、PMMoV-Iw、PMMoV-P2、PMMoV-Kr編碼的氨基酸序列相同。

2.4 系統進化樹分析

通過MEGA5.2軟件,采用NJ法構建PMMoV進化分析樹顯示,PMMoV分成2個大的支系群體,PMMoV-Ia與PMMoV-P3進化成一個支系,其他PMMoV分離物進化成另外一個支系,在這一支系中PMMoV-HN1(KP345899)與PMMoV-CN(AY859497)親緣關系最近,在煙草花葉病毒屬成員中,PMMoV與TMV和ToMV親緣關系最近。

表5 PMMoV-HN1與其他來源的PMMoV分離物及同屬其他病毒的一致性分析1)

Table 5 Identity analysis of PMMoV-HN1 with other PMMoV isolates and tobamovirus isolates

病毒分離物Isolate基因組GenomeNT/%5'-非編碼區5'-UTRNT/%3'-非編碼區3'-UTRNT/%開放閱讀框1ORF1NT/%AA/%開放閱讀框2ORF2NT/%AA/%開放閱讀框3ORF3NT/%AA/%開放閱讀框4ORF4NT/%AA/%PMMoV-J99.799.510099.699.999.799.999.499.6100100PMMoV-C-142199.799.510099.699.899.799.899.499.6100100PMMoV-S99.699.510099.699.999.799.899.399.299.8100PMMoV-Pa1899.599.510099.599.699.699.799.499.699.8100PMMoV-TPO-2-1999.599.510099.499.699.599.799.499.699.8100PMMoV-CN99.599.510099.599.799.699.899.299.699.1100PMMoV-LS99.599.510099.499.599.599.599.398.899.599.3PMMoV-RP99.499.410099.399.199.499.399.299.699.5100PMMoV-BR-DF0199.399.510099.299.799.499.898.398.499.8100PMMoV-HP199.099.510098.999.499.199.598.998.498.7100PMMoV-PMMVOU298.397.310098.699.898.399.698.198.498.1100PMMoV-Iw97.397.498.597.299.497.299.397.898.097.6100PMMoV-P297.397.498.597.299.397.199.397.898.497.9100PMMoV-Kr97.397.498.597.199.397.199.297.698.098.1100PMMoV-L4BV97.297.498.597.299.597.299.497.698.497.298.7PMMoV-Ia94.497.498.594.498.494.198.394.796.994.596.8PMMoV-P394.296.910094.198.494.098.394.796.994.198.1ObPV-Ob58.157.373.562.665.164.267.861.359.166.670.0ORSV55.558.164.356.957.057.457.262.965.063.967.3PaMMV-Japanese57.850.568.162.464.760.268.062.663.766.270.7TMV-Cg55.162.967.156.958.558.363.148.959.552.547.1TMGMV61.454.566.661.961.864.265.263.161.065.470.0ToMV-Queensland65.863.466.168.874.470.476.963.761.467.573.9TMV-Rakkyo65.160.983.367.773.369.075.564.061.864.170.7

1) NT 表示核苷酸序列的一致性;AA 表示氨基酸序列的一致性。 NT indicates the identity of the nucleotide sequence; AA indicates the identity of the amino acid sequence.

圖2 不同來源的PMMoV分離物及同屬其他病毒的全基因組序列系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of whole-genome sequences of PMMoV isolate and other tobamovirus isolates

3 討論

PMMoV在辣椒葉片上呈現輕微的褪綠或者斑駁癥狀,其發病特征與煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)和辣椒脈斑駁病毒Chilliveinalmottlevirus(ChiVMV)相似,但其癥狀嚴重程度隨季節及環境因素變化,難以通過癥狀特點對病毒進行鑒定。PMMoV侵染的相關報道主要集中在華北及華中地區,最近新疆、貴州、東北、浙江等地[9-10,12-14]也相繼檢測出PMMoV,并提出了一些分子檢測方法。然而PMMoV對湖南辣椒的侵染鮮有報道。本研究于2013年從‘興蔬215’,‘興蔬301’,‘湘研15號’,‘湘研16號’,‘博辣5號’,‘博辣6號’等10個湖南主要栽培品種中采集到196份疑似病毒感染的辣椒樣本,進行RT-PCR檢測,并測序確定PMMoV對湖南辣椒的侵染,對RT-PCR檢測中擴增得到的PMMoV CP基因序列比對發現相似度為100%。隨機選取PMMoV病毒侵染樣本進行單斑分離后,克隆PMMoV湖南分離物基因組全序列,命名為PMMoV-HN1,并進行結構和系統進化分析,結果表明:PMMoV-HN1與中國報道的PMMoV-CN在親緣關系上最近,表現出一定的地理相關性,與PMMoV-CN相比較,PMMoV-HN1全基因組序列的長度與PMMoV-CN序列長度完全相同,編碼126 kD蛋白區域(70～3 423 nt)、編碼183 kD蛋白區域(70～4 908 nt)、編碼28 kD蛋白區域(4 909～5 682 nt)和編碼17.5 kD蛋白區域(5 685～6 158 nt)亦在同一個位點上,而3′-UTR與PMMoV-CN完全相同[8,15],推測PMMoV-HN1與PMMoV-CN一樣可以克服辣椒的L3抗性基因;同時PMMoV-HN1 CP基因序列與PMMoV-J、PMMoV-C-1421序列完全相同,而編碼的氨基酸與PMMoV-J、PMMoV-C-1421、PMMoV-S、PMMoV-Pa18、PMMoV-TPO-2-19、PMMoV-RP、PMMoV-BR-DF01、PMMoV-HP1、PMMoV-PMMVOU2、PMMoV-Iw、PMMoV-P2、PMMoV-Kr所編碼的氨基酸序列完全相同,進一步說明PMMoV-HN1與PMMoV-CN相同可以突破辣椒的L3抗性基因。同時通過CP基因序列和氨基酸的比對說明PMMoV的CP基因高度保守,可根據CP基因設計PMMoV特異性檢測引物。二級結構顯示PMMoV-HN1在5′端有一個明顯的發夾結構,這個結構可能具有終止mRNA轉錄及保持ssRNA穩定性的作用[16],PMMoV5′-UTR基因的生物學功能有待進一步研究。檢測發現侵染湖南辣椒的PMMoV CP基因序列相似度為100%,沒有克隆侵染不同品種或不同地區的PMMoV的全基因,湖南地區的PMMoV病毒序列是否存在株系分化、侵染特性是否存在差異,還有待進一步研究。檢測中發現PMMoV-HN1與ChiVMV和蠶豆萎蔫病毒2號Broadbeanwiltvirus2 (BBWV2)存在復合侵染現象,復合侵染的發生是否影響這些病毒對辣椒的侵染,是否導致病毒的發生規律、病毒的變異及分子進化發生變化,我們將進行進一步探索。

PMMoV影響辣椒的產量和品質,嚴重危害辣椒的生產。其可通過種子與染毒汁液摩擦傳毒,在植物病株殘體上可存活25年左右,帶毒種子、感病植株和帶病土壤是重要的侵染源[3]。最近的研究表明,辣椒進行工業加工后其工業產品中亦存在PMMoV[17]。同時,污水[18]與飲用水源[19]中亦存在著PMMoV。Colson等[20]從患病的人類糞便中檢測到PMMoV,通過試驗證明免疫反應與患者體內的PMMoV相關,同時他們將糞便中獲得的PMMoV接種到寄主植物上表現出侵染癥狀,證明人類排泄物中的病毒RNA仍具有侵染活性,推測人類在此病毒的傳播過程中可能也作為傳播媒介。說明該病毒不僅可以通過種子進行傳播,亦可以通過水源或人類的活動作為傳播途徑,從而增大了對PMMoV的監控難度。陳青等[21],郭京澤等[22]分別自我國臺灣和韓國的進境辣椒種子中檢測發現PMMoV。本研究檢測到PMMoV-HN1,但其發生規律和傳播途徑還不清楚,我們正在進行相關研究。

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(責任編輯：田 喆)

Whole-genome sequence and structural analysis ofPeppermildmottlevirusisolate HN1

Liu Xiangning1,3, Dai Liangying1,3, Li Wei1,3, Dong Zheng1,3, Tang Qianjun1,2,3

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.InstituteofVirology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.HunanProvincialKeyLaboratoryforBiologyandControlofPlantDiseasesandInsectPests,Changsha410128,China)

Pepper samples were collected from Hunan, and identified asPeppermildmottlevirus(PMMoV). According to the previously reported gene conserved regions of PMMoV, six pairs of degenerate primers were designed. The 6 356 bp whole-genome sequence (PMMoV-HN1, accession no. KP345899) was obtained. There were four open reading frames, encoding four proteins, including 126 kD protein (70-3 423 nt), 183 kD protein (70-4 908 nt), 28 kD protein (4 909-5 682 nt) and 17.5 kD protein (5 685-6 158 nt). The 5′-non-coding region (5′-UTR) and the 3′-non-coding region (3′-UTR) contained 69 and 198 nucleotides, respectively, in which 5′-UTR had a sequence of m7G5′pppG methylation in the nucleotide cap structure. Identity analysis found that the nucleotide identity of PMMoV-HN1 and other PMMoV isolates was 94%-99%, and the identity of the encoded amino acids was 94%-99%. Phylogenetic analysis showed the closest phylogenetic relationships between PMMoV-HN1 and PMMoV-CN.

pepper; PMMoV; whole-genome sequence; sequence analysis

2016-04-21

2016-06-02

公益性行業(農業)科研專項(201303028);國家自然科學基金(31101413);湖南省煙草公司科技計劃項目(13-14ZDAa04,14-16ZDAa02)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.014

* 通信作者 E-mail:tangqianjun78@163.com