多重PCR檢測籽用西葫蘆種子帶毒及熱處理脫毒效果分析

任琛榮, 周登攀, 都業娟, 向本春

(石河子大學農學院, 新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區普通高校重點實驗室, 石河子 832003)

實驗方法與技術

多重PCR檢測籽用西葫蘆種子帶毒及熱處理脫毒效果分析

任琛榮, 周登攀, 都業娟, 向本春*

(石河子大學農學院, 新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區普通高校重點實驗室, 石河子 832003)

為了明確籽用西葫蘆種子攜帶病毒的情況,以籽用西葫蘆種子為材料,采用多重PCR技術檢測種子帶毒率。同時為了篩選出有效脫除病毒的方法,通過相對定量法分析了不同溫度濕熱和干熱處理對種子攜帶病毒的鈍化效果。結果表明,從7個籽用西葫蘆品種種子幼苗中均可檢測到CMV、ZYMV及WMV,其檢出率分別為67.1%、50.0%和72.3%,多個病毒的復合檢出率為66%。不同品種種子幼苗的病毒檢出率有明顯差異,其中‘粒豐9號’種子幼苗的病毒檢出率最低,為60%,而‘京豐9號’,‘瑞豐9號’,‘綠豐9號’及‘金葫360’的病毒檢出率均為100%。8種處理均能不同程度降低籽用西葫蘆種子幼苗的帶毒率,其中干熱60、70、75℃,濕熱75℃處理同時脫除WMV、CMV和ZYMV的效果最好。

籽用西葫蘆; 種子; 帶毒率; 種子處理

籽用西葫蘆籽粒營養價值高,口感好,廣受國內外人們的喜愛,成為近年來在新疆發展較快的新興產業之一,且種植面積逐步擴大。近期調查發現,病毒病是籽用西葫蘆生產種植中普遍發生的病害,引起植株葉片畸形,果實畸形壞死,產籽量低,甚至落花,落果,造成嚴重的經濟損失,成為制約籽用西葫蘆產業發展的重要障礙[1]。籽用西葫蘆屬葫蘆科作物。已報道的葫蘆科作物種傳病毒共有11種[2], 如黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)[3]、西瓜花葉病毒Watermelonmosaicvirus(WMV)[4]、小西葫蘆黃花葉病毒Zucchiniyellowmosaicvirus(ZYMV)[3]、番木瓜環斑病毒西瓜株系Papayaringspotvirus-watermelon(PRSV-W)[5]及黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV)[6]等。其中CMV是雀麥花葉病毒科Bromoviridae黃瓜花葉病毒屬Cucumovirus的典型種,寄主范圍廣泛,能侵染85科1 000多種植物[7]。而WMV、ZYMV及PRSV-W均是馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus的成員,這4種病毒主要由瓜蚜、桃蚜等75種蚜蟲傳播,也可通過機械、種子等傳播。目前,有關籽用西葫蘆種子是否帶毒,帶何種病毒以及在何種熱處理條件下能有效脫除種子攜帶的病毒等研究尚未見報道。加強種子帶毒率檢測,從源頭阻斷病毒病害的流行,蔓延,對籽用西葫蘆產業的發展具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

種子樣品來自石河子市面上農資公司所售的籽用西葫蘆種子,品種分別為:‘芳新源’、‘京豐9號’、‘瑞豐9號’、‘粒豐5號’、‘粒豐9號’、‘綠豐9號’、‘金葫360’。mRT-PCR所用的陽性對照為本實驗室保存的同時攜帶ZYMV、 CMV、 WMV、PRSV-W的西葫蘆葉片。大腸桿菌DH5α菌株為本實驗室保存。

1.2 試驗試劑

RNA提取試劑TRIzol購自TaKaRa公司；反轉錄試劑盒購自Thermo公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、TaqPCR Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自北京康為世紀生物科技有限公司；2000 bp DNA marker購自全式金生物；熒光定量SYBR GreenⅠ購自Invitrogen生物技術有限公司;其他化學試劑均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 建立多重PCR反應體系

1.3.1.1 引物的設計和合成

根據GenBank上登錄的各病毒序列，用 Primer Premier 5.0引物設計軟件分別設計以18S rRNA為內標的多重PCR引物和以β-actin為內參的熒光定量特異性引物。表1中擴增長度為242、372、449和571 bp 的引物分別為擴增WMV、CMV、PRSV-W和ZYMV的特異引物；將這4對引物和長度為1 036 bp的18S rRNA內標引物混合用于多重PCR；長度為115、151、115 bp的引物和 92 bp的β-actin引物用于WMV、CMV和ZYMV的相對表達量測定。PCR引物由北京華大科技有限公司合成。

表1 擴增病毒和內標片段的特異性引物

Table 1 Specific primers for amplifying segments of ZYMV, PRSV-W, CMV, WMV and 18S rRNA

病毒和內標Virusandinternalcontrol編號Codeno.序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴增長度/bpProductlengthWMV5'端引物3'端引物5'端引物3'端引物GGATGGGGAAGAGCAAGTTGAGCTTCTCTTGCCCTGTTTGGTGTGAGTTTGGGTGATGATGGATGGGTCTGCTGCGTCTGAGAAATGGTG242115CMV5'端引物3'端引物5'端引物3'端引物ATCAACCAGTGCTGGTCGTAACGGAACTTTACGGACTGTCACCCCGGATGCTAACTTTAGAGTCTTGTCGGTGGCTTTAGGGTAATAGATGTG372151PRSV-W5'端引物3'端引物GTCAATGTTGGGACCAGTGGAACGCGGCATGTATCTCTCAGTAG449ZYMV5'端引物3'端引物5'端引物3'端引物AACAGTAGCAGCTGTCACGAAGGCGGGCTCTTTCAGGAGTTTTAACGGTTGTTGTGAATCAGTGTCTGAGTTTTGTGGTTTATCCCCTTT57111518SrRNA5'端引物3'端引物CTGAGAAACGGCTACCACATCTGTTATTGCCTCAAACTTCC1036β-actin5'端引物3'端引物AATCCACGAAACTACCTACAACTCCTTGAACCACCACTGAGGACGATG92

1.3.1.2 優化多重PCR反應體系

針對影響多重PCR擴增效果的退火溫度、TaqDNA聚合酶濃度、dNTPs濃度,在反轉錄條件不變的情況下,進行多重PCR反應體系的優化。優化某一因素時,其他因素不變。退火溫度:設50、52、54、56、58、60、62、64℃ 8個處理；TaqDNA聚合酶濃度:設0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4 U/μL 8個處理；dNTPs濃度:設0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 8個處理。

1.3.1.3 檢測多重PCR的靈敏度

用蛋白核酸儀測定CMV、ZYMV、WMV和PRSV-W的核酸濃度,并用超純水以30、3-1、3-2、3-3、 3-4、3-5、3-6的稀釋倍數進行病毒RNA的稀釋,各濃度取1 μL進行單重及多重PCR反應,檢測其靈敏度。

1.3.2 籽用西葫蘆種子帶毒檢測

1.3.2.1 籽用西葫蘆幼苗的培育

從市面上隨機抽取7個籽用西葫蘆品種,每個品種取50粒種子,分別播于經180℃, 8 h高溫滅菌的土中,室溫下培養。待長至四葉期,每個品種隨機取30株幼苗進行病毒檢測。

1.3.2.2 多重PCR檢測

采用RNAiso Plus試劑盒用改良TRIzol法提取植株總RNA。

cDNA第一鏈的合成:將5 μL總RNA模板,1 μL oligo(dT)18引物與6 μL無核酸酶的高純水輕輕混勻,短暫離心,65℃孵育5 min,冰上冷卻,離心后加4 μL 5×第一鏈反應緩沖液,1 μL RiboLockTMRNA酶抑制劑,2 μL 10 mmol/L dNTPs Mix, 1 μL Revert AidTMM-MnLV逆轉錄酶,輕輕混勻,離心,42℃孵育60 min,70℃加熱5 min終止反應,-60℃保存備用。

采用多重PCR,以18S rRNA為內標檢測種子所帶病毒[9-11]。多重PCR反應:以cDNA第一鏈為模板進行PCR。25 μL反應體系:cDNA 3 μL, 10 μmol/L特異性引物,包括18S rRNA 0.5 μL、WMV 0.8 μL、CMV 1 μL、ZYMV 0.8 μL和PRSV-W 1 μL,10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTPs(10 mmol/L)1 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL,加ddH2O至終體積為25 μL。PCR擴增條件:94℃預變性3 min；94℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環；后72℃延伸10 min,4℃保存。反應結束后,PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統觀察結果并照相,統計檢出率。檢出率(%)=(檢出病毒種子數/抽檢種子總數)×100。

1.3.2.3 PCR產物的克隆及測序

用凝膠回收試劑盒純化目的片段,在4℃連接至pMD18-T載體,轉化到大腸桿菌感受態細胞中,經紅白斑篩選,挑取陽性克隆,送至北京華大公司測序。

1.3.3 籽用西葫蘆種子的熱處理

1.3.3.1 熱處理方法

濕熱法:將120粒‘京豐9號’種子平均分為4份,每份30粒,分別在60、65、70和75℃熱水中處理10 min,再放入滅菌水中浸泡24 h,瀝出晾干備用；

干熱法:將120粒‘京豐9號’種子平均分為4份,每份30粒,先用烘箱40℃加熱24 h,再將每份種子樣品分別用60、65、70和75℃加熱72 h,待種子溫度降至室溫備用。

將每種處理后的種子分別播于裝有經過180℃,8 h高溫滅菌土的試驗缽中,室溫下培養。同時以室溫,滅菌水浸泡的種子為對照處理。

1.3.3.2 分析熱處理效果的方法

以多重PCR檢測種子的熱處理效果,方法同種子帶毒檢測,并統計脫毒效率。脫毒效率(%)=(1-處理后的帶毒率/對照帶毒率)×100 。

以β-actin為內參,用熒光定量PCR確定種子熱處理后病毒的相對表達量。以未經熱處理,室溫滅菌水浸泡的種子為對照。每處理取10粒種子,重復3次,每個重復再重復3次上機檢測。熒光定量PCR反應體系為10 μL,其中SYBR premixExTaqTM5 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至終體積為10 μL。熒光定量PCR擴增條件為:94℃預變性3 min；94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環；后72℃延伸10 min,4℃保存。

熒光定量數據用Sigma Plot 12.5軟件分析,并用SPSS軟件分析其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 多重PCR反應體系的建立

2.1.1 多重PCR的特異性

以經鑒定同時攜帶CMV、ZYMV、WMV和PRSV-W的籽用西葫蘆葉片為陽性對照,無毒苗為陰性對照,分別進行單重和多重PCR,結果(圖1)表明,分別以各病毒的特異引物進行單重PCR擴增,陽性對照可分別得到大小為242、372、449、571 bp的WMV、CMV、PRSV-W、ZYMV的目的條帶,而將這4種病毒的特異引物和18s rRNA引物混合后進行多重PCR,陽性對照仍可得到預期的目的條帶,且條帶的亮度及清晰度均較好,而陰性對照只擴增得到1 036 bp的18S rRNA。用同一RNA進行mRT-PCR反應,得到的目的條帶與sRT-PCR擴增條帶大小一致,說明mRT-PCR能同時檢測這4種病毒。

圖1 單重及多重PCR的特異性比較Fig.1 Comparison of specificity for multiplexPCR and simplex PCR

2.1.2 多重PCR反應體系的優化

退火溫度優化結果(圖2a)顯示,54～64℃均可擴增出5條帶,且退火溫度在58～64℃范圍內目的條帶較清晰,其中62℃的目的條帶最清晰,明亮,效果最好,因此本試驗選62℃為最佳退火溫度。

TaqDNA聚合酶量優化結果(圖2b)顯示,TaqDNA聚合酶量在0、0.5、1.0、1.5、2、2.5和3 U/μL時均可擴增出5條目的條帶,但TaqDNA聚合酶量為1.5 U/μL時擴出的5條帶比1.0 U/μL清晰,且隨著酶量的增加,條帶再沒有明顯變化,因此本試驗選1.5 U/μL為最佳TaqDNA聚合酶量。

dNTPs濃度優化結果見圖2c,dNTPs濃度在0.6 、0.8和1.0 mmol/L時,擴增出各條帶較好,且0.8 mmol/L的dNTPs濃度較0.6 mmol/L擴增的條帶清晰,與1.0 mmol/L擴增的條帶沒有明顯變化,因此選0.8 mmol/L為本試驗的dNTPs濃度。

圖2 多重PCR主要參數的優化Fig.2 Optimization for the three main parameters of mRT-PCR

2.1.3 多重PCR的靈敏度

以1 μL稀釋30、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6倍的RNA為模板分別進行單重和多重RT-PCR。進行單重PCR時,WMV、CMV、PRSV-W和ZYMV的靈敏度分別為3-5、3-4、3-2和3-6，與多重PCR的擴增結果基本相符合(圖3)。說明多重PCR與單重PCR的靈敏度相同。

2.2 籽用西葫蘆種子帶毒檢測

選取7個籽用西葫蘆品種,每個品種取50粒種子育苗至4葉期,用多重PCR技術檢測樣品的帶毒率及復合帶毒率。結果(表2)表明,從新疆石河子市面上所售的7個籽用西葫蘆品種的種子中均檢測出CMV、WMV及ZYMV,且均未檢測出PRSV-W。不同品種種子病毒的檢出率不同,7個品種中有4個品種種子的病毒檢出率均為100%,檢出率最低的品種為‘粒豐9號’,為60%。不同品種種子所帶的主要病毒不同,CMV檢出率最高的品種為‘綠豐9號’,達92%,而‘粒豐9號’的檢出率只有50%；ZYMV檢出率最高的品種是‘瑞豐9號’，為80%,最低檢出率是‘粒豐5號’，為22%； CMV、ZYMV和WMV的復合檢出率在‘瑞豐9號’中最高，為60%,在‘粒豐5號’中最低，為0。所有種子病毒的平均檢出率為86%,其中CMV檢出率為67.1%,ZYMV檢出率為50%,WMV檢出率為72.3%,而2種病毒復合檢出率為28%,3種病毒復合檢出率為38%。95.62%檢測為陽性的植株不表現任何病毒癥狀,只有個別植株表現葉片畸形,褪綠斑點癥狀。

2.3 溫度處理對籽用西葫蘆種子的影響

2.3.1 熱處理對籽用西葫蘆種子脫毒的影響

多重PCR檢測結果表明,不同溫度濕熱和干熱處理都具有脫毒作用,但干熱處理比濕熱處理效果更好,其中,65℃濕熱處理脫毒效果最差,75℃干熱處理脫毒效果最好,可達96%。

圖3 多重PCR靈敏度的測定Fig.3 Detection of mRT-PCR sensitivity

品種Variety總檢出率/%Totaldetectionrate各病毒檢出率/%VirusdetectionrateCMVZYMVWMV復合檢出率/%CompositedetectionrateCMV+ZYMVZYMV+WMVCMV+WMVCMV+ZYMV+WMV芳新源 Fangxinyuan74.064.068.064.08.06.0054.0京豐9號 Jingfeng-9100.078.056.0100.00022.056.0瑞豐9號 Ruifeng-9100.070.080.0100.0020.010.060.0粒豐5號 Lifeng-568.056.022.012.012.0012.00粒豐9號 Lifeng-960.050.040.050.00020.030.0綠豐9號 Lvfeng-9100.092.054.090.00046.046.0金葫360 Jinhu360100.060.030.090.0010.030.020.0均值 Averagevalue86.067.150.072.32.95.120.038.0

相對熒光定量PCR結果顯示,從脫除病毒種類來看,8種處理均能不同程度脫除種子攜帶的CMV、ZYMV以及WMV。差異顯著性分析結果表明:在P<0.05時,熱處理對WMV脫毒效果最為顯著,對CMV的脫毒效果較差；在8種處理下,CMV的相對表達量均顯著下降；ZYMV除65℃濕熱處理外,其他溫度處理后病毒相對表達量均顯著降低；WMV相對表達量也顯著降低,其中干熱60、70、75℃以及濕熱75℃處理和常溫處理的對照相比差異最為顯著(圖4)。

2.3.2 溫度處理對種子發芽率及發芽勢的影響

8種處理均不同程度地降低籽用西葫蘆種子的發芽率和發芽勢,其中對發芽勢的影響明顯大于發芽率(圖5)。從發芽率看,播種15 d后,對照種子發芽率為98%,60、65、70、75℃干熱和濕熱處理的種子發芽率分別為96%、95%、93%、92%和97%、96%、94%、93%。可看出,隨溫度的升高,發芽率依次下降,干熱75℃處理較對照下降6%。

從發芽勢來說,播種10 d后,對照種子發芽勢為96%,60、65、70、75℃干熱處理的發芽勢為92%、86%、72%、65%,60、65、70、75℃濕熱處理種子的發芽勢為94%、90%、82%、73%。溫度處理對發芽勢的影響明顯大于發芽率,其中75℃干熱處理對發芽勢的影響最大,較對照處理下降31%。

3 討論

目前,多重PCR技術已廣泛應用于食品[12]、醫學[13]等領域。而用多重PCR檢測葫蘆科病毒的研究較少,特別是關于籽用西葫蘆種子攜帶病毒的研究尚未見報道。籽用西葫蘆病毒病在其種植區均發生嚴重,尤其是在石河子等地,ZYMV、CMV、WMV及PRSV-W是侵染籽用西葫蘆的主要病毒[1]。由于籽用西葫蘆種子較難提取RNA,本試驗用滅過菌的土壤種植籽用西葫蘆,待其長至四葉期進行病毒檢測。由于種子至幼苗的成長周期中,土壤等都經過滅菌處理,因此,從幼苗中檢測到的病毒基本可認為是種子中所帶的病毒。本試驗對多重PCR反應體系進行了優化，確定了最佳退火溫度為62℃,TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U/μL,dNTPs濃度為0.8 mmol/L,并且驗證了多重PCR的靈敏度,建立了可靠的檢測籽用西葫蘆ZYMV、CMV、WMV及PRSV-W的多重PCR體系。可為生產中檢測籽用西葫蘆病毒病提供一套簡單、快速、有效的方法。

圖4 經不同溫度處理后的種子中CMV,ZYMV和WMV的相對表達量(P<0.05)Fig.4 Relative expression level of CMV, ZYMV and WMV after seed treatment with different temperatures(P<0.05)

圖5 不同處理對種子發芽率及發芽勢的影響Fig.5 The effect of different treatments on germinationrate and germination energy of seeds

葫蘆科植物種傳病毒種類雖不多,但大多數具有很高的檢疫重要性。葫蘆科種子一旦帶毒率過高,通過種子貿易及遠距離調運等,在適宜的溫濕度下可引起葫蘆科病毒病的大暴發,最終造成嚴重的經濟損失,因此加強種子帶毒檢測,從源頭控制病毒病害的蔓延,對籽用西葫蘆產業的安全生產具有重要意義。本試驗采用建立的多重PCR技術,在7種籽用西葫蘆種子中成功檢測到其攜帶的CMV、ZYMV和WMV。其中‘京豐9號’、‘瑞豐9號’、‘綠豐9號’和‘金葫360’ 這4個品種的種子帶毒率均為100%,而‘粒豐9號’種子的帶毒率僅60%。說明不同品種種子的帶毒率不同。

由于生產實踐中種子使用量大,實際操作人員專業技術有限,對種子直接進行脫毒處理是鈍化病毒最簡單有效的方法[8, 14]。日本和韓國針對黃瓜綠斑駁花葉病毒采取以干熱處理為主的綜合防治措施,卓有成效[15]。本試驗采用60、65、70和75℃ 4個溫度梯度干熱和濕熱處理籽用西葫蘆種子,再用熒光定量PCR技術檢測熱處理后的種子中CMV、ZYMV及WMV的相對表達量。結果表明,在40℃處理24 h,70℃干熱處理72 h條件下脫除CMV效果最好,ZYMV在75℃濕熱處理10 min,冷水處理24 h下的脫毒效果最好,而WMV則在40℃處理24 h,60℃干熱處理72 h條件下脫毒效果最好。本研究利用熱處理可有效脫除籽用西葫蘆種子攜帶的病毒,從源頭阻斷病毒的發生,研究方法可為籽用西葫蘆病毒病的防治提供一定參考。

[1] 任琛榮, 郝小軍, 都業娟, 等. 新疆石河子及新湖籽用西葫蘆病毒病分子檢測[J]. 北方園藝, 2016(1): 102-106.

[2] 林石明, 廖富榮, 陳青, 等. 葫蘆科作物種傳病毒及其檢疫重要性[J]. 植物檢疫, 2012, 26(1): 52-61.

[3] Zitter T A, Hopkins D L, Thomas C E. Compendium of cucurbit diseases [M]. St Paul, MN: The American Phytopathological Society, 1996.

[4] Fletcher J D, Wallace A R, Rogers B T.Potyvirusesin New Zealand buttercup squash(CucurbitsmaximaDuch.): Yield and quality effects of ZYMV and WMV 2 virus infections [J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 2000, 28(1): 17-26.

[5] Ranebennur H. Diagnosis and management ofPapayaringspotvirusin cucurbits [D]. Dharwad: College of Agriculture, Dharwad University of Agricultural Sciences, 2005.

[6] 吳會杰, 秦碧霞, 陳紅運, 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒西瓜、甜瓜種子的帶毒率和傳毒率[J]．中國農業科學, 2011, 44(7): 1527-1532.

[7] Roossinck M J. Pathogen profileCucumbermosaicvirus, a model for RNA virus evolution [J]. Molecular Plant Pathology, 2001,2(2): 59-63.

[8] Kim D H, Lee J M. Seed treatment forCucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV) in gourd (Lagenariasiceraria) seeds and its detection [J]. Journal of the Korean Society for Horticultural Science, 2000, 41(1): 1-6.

[9] 王沖, 陳集雙, 洪健, 等. 以18S rRNA 為內參照的多重RT-PCR檢測 3種百合病毒[J]. 植物病理學報, 2006, 36(3): 204-211.

[10]牛建新, 馬兵鋼, 何梅, 等. 庫爾勒香梨主要病毒多重RT-PCR 檢測技術研究[J]. 植物病理學報, 2006, 36(1): 12-21.

[11]趙麗, 古勤生, 陳紅運, 等. 葫蘆科作物3種主要病毒的多重RT-PCR方法的建立[J]. 果樹學報, 2008, 25(5): 703-707.

[12]何瑋玲, 張馳, 楊靜, 等. 食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J]. 中國農業科學, 2012, 45(9): 1873-1880.

[13]李瑾, 毛乃穎, 秦萌, 等. GeXP多重PCR技術同時檢測12種常見呼吸道病毒[J]. 病毒學報, 2011,27(6): 526-532.

[14]Dawson W O, Kuhn C W. Kinetics of multiplication, inactivation, and particle-breakdown ofCowpeachloroticmottlevirusin cowpea [J]. Phytopathology, 1974, 64(7): 951-957.

[15]蔡明, 李明福, 江東. 日本、韓國黃瓜綠斑駁花葉病毒發生及防控策略[J]. 植物檢疫, 2010, 24(4): 65-68.

(責任編輯:楊明麗)

Detection of viruses in seeds of seed-zucchini and evaluation of heat treatment on virus elimination

Ren Chenrong, Zhou Dengpan, Du Yejuan, Xiang Benchun

(KeyLaboratoryatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegionforOasisAgriculturalPestManagementandPlantProtectionResourceUtilization,CollegeofAgriculture,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

To determine whether seeds of seed-zucchini are infected by viruses and screen the efficient elimination method, the seed-borne virus rate was detected by multiplex RT-PCR, and virus elimination efficiency was evaluated by fluorescence real-time RT-PCR after moist and dry heat treatments under different temperatures. The result showed that CMV, ZYMV and WMV were detected from seedling of seed-zucchini, with the detection rates of 67.1%, 50.0% and 72.3%, respectively, while the composite detection rate was 66%. Different varieties of seed-zucchini seedling had different virus detection rates, the lowest ratio was 60% (‘Lifeng-9’) and the highest rate was 100% (‘Jingfeng-9’, ‘Ruifeng-9’, ‘Lvfeng-9’and ‘Jinhu360’). Wet and dry heat treatments had some influence on seed-borne virus rate. Dry heat treatments had the highest virus elimination rate for WMV, CMV and ZYMV at 60, 70 and 75℃, so did the wet heat treatment for the three viruses at 75℃.

seed-zucchini; seeds; seed-borne virus rate; seed treatment

2016-04-04

2016-06-03

兵團農作物病害安全防控創新團隊(2101802CX7155)

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.020

ExperimentalMethod&Technology

* 通信作者 E-mail: XBC@shzu.edu.cn