侵染廣東番茄的番茄褪綠病毒分子鑒定

湯亞飛, 何自福*, 佘小漫, 藍國兵

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640)

研究簡報

侵染廣東番茄的番茄褪綠病毒分子鑒定

湯亞飛1,2, 何自福1,2*, 佘小漫1, 藍國兵1

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640)

在廣東番茄上發現一種新病害，病株表現為葉片褪綠，葉脈顏色變深及葉片增厚等癥狀。利用番茄褪綠病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)HSP70基因的兩對特異引物對番茄病樣進行RT-PCR檢測，結果表明，從所采集的6份病樣中均擴增到預期大小的DNA特異片段。對其中1份樣品的擴增片段進行克隆與序列分析，結果表明，擴增片段包括1個長度為1 665個核苷酸的完整病毒基因，其核苷酸序列與已報道的ToCVHSP70基因有較高的同源性，表明廣東番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV廣東番茄分離物的HSP70序列與國內外已報道的各分離物的同源性均低于82%，存在較大差異，其中與塞浦路斯tomato、約旦JU_20分離物的同源性最高，為81.8%。這是ToCV在廣東發生的首次報道，也是該病毒HSP70基因序列存在顯著差異分離物的首次發現。

番茄病毒病; 番茄褪綠病毒;HSP70基因

番茄褪綠病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)屬于長線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinvirus,其基因組為二分體正義單鏈RNA(+ssRNA),RNA1和RNA2分別包裝在2種不同的病毒粒子中,RNA1含4個ORFs,編碼與病毒復制相關蛋白等,RNA2含9個ORFs,編碼外殼蛋白(CP)和熱激蛋白(HSP70)等[1-2]。該病毒可由煙粉虱BemisiatabaciGennadius、溫室白粉虱TrialeurodesvaporariorumWestwood、紋翅粉虱T.abutiloneaHaldeman 、銀葉粉虱B.argentifoliiBellows and Perring以半持久方式傳播[1-2],但不能經機械摩擦傳播。該病毒可侵染茄科、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍雪科等科的多種植物[3]。番茄感染ToCV后,植株下部葉片黃化,葉脈濃綠而脈間褪綠,葉片變脆易折,嚴重時葉片黃褐色,甚至出現壞死等癥狀,番茄品質與產量嚴重下降[4]。

ToCV最早于1998年在美國佛羅里達州被發現[5],隨后在歐洲[6-8]、非洲[9]、亞洲[10-15]、南美洲[16]、北美洲[17-19]等多個國家和地區相繼被報道。我國2004年首次在臺灣番茄上發現該病毒[13],爾后直到2012年一直未見該病毒的相關報道;但自2013年開始,該病毒陸續在江蘇[20]、北京[14,21]、山東[4,22-23]、河南[24]、河北[25]、天津[26]等蔬菜產區被發現。2015年初,我們在廣東省惠州市番茄產區發現了疑似被ToCV侵染的番茄病株,且植株上煙粉虱數量較多。為了弄清該病害的病原種類,筆者對病樣進行了分子檢測與鑒定。

1 材料與方法

1.1 番茄病樣

番茄病樣葉片于2015年1月采自廣東省惠州市番茄產區,共6份,編號為GD01～GD06。田間病株表現為下部葉片首先發病,葉片脈間變黃,葉脈顏色加深變成深綠色,葉片增厚,發病嚴重時植株死亡。

1.2 番茄葉組織總RNA提取

應用RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)抽提番茄病樣葉片的總RNA。分別取6個番茄病樣和1個健康番茄樣品的葉組織100 mg,按照試劑盒說明書的步驟抽提總RNA,最終將RNA沉淀溶解于40 μL DEPC處理的ddH2O中。

1.3 RT-PCR檢測

分別以抽提的番茄葉片總RNA作為模板,用隨機引物(TaKaRa公司)逆轉錄合成cDNA。反應體系和具體步驟為:模板RNA 4 μL,50 μmol/L random 6 mers引物 1 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,RNase-free dH2O 4 μL；65℃變性5 min后,冰上迅速冷卻，然后再加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer(TaKaRa)4 μL、RNase Inhibitor (40 U/μL)0.5 μL、PrimeScript Ⅱ RTase(200 U/μL)1 μL和RNase-free dH2O 4.5 μL,反應體系總體積為 20 μL,30℃孵育10 min后,42℃孵育50 min,最后70℃反應15 min使酶失活。

進一步利用ToCVHSP70 基因的2對特異引物HSP1-F/R(HSP1-F:GTTAACTCAGTTTAACTTGATTCCG;HSP1-R:CACTTGACCAAATCGTCAAACG)和HSP2-F/R(HSP2-F:CATACAATATAATAAGTGATGATGGGAG; HSP2-R:CAAGACAGTTAGTTCTCAGTACTAAAC)[12]分別進行PCR擴增。反應體系為:反轉錄產物 1 μL,滅菌水 9.5 μL,PCR Mixer 12.5 μL(TaKaRa)10 μmol/L上下游引物各 1 μL,總體積為 25 μL。反應程序:94℃ 4 min;94℃ 45 s,50℃ 45 s,72℃ 60 s,35 個循環;72℃ 10 min。PCR產物經1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PCR產物克隆和測序

采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京全式金生物技術有限公司) 回收病樣GD01的PCR特異條帶,純化后克隆到 pMD20-T 載體(TaKaRa)上,并轉化大腸桿菌菌株 DH5α,隨機挑取3個陽性克隆送上海生工生物技術有限公司測序。

1.5 序列分析

利用DNAStar軟件(DNASTAR Inc,Madison,USA)對所獲得的基因序列進行拼接,利用BLAST程序進行序列相似性搜索,進一步用DNAStar的MegAlign進行序列比較分析,進化樹構建采用MEGA 5.05的鄰接法(neighbor joining,NJ)。

2 結果與分析

2.1 病樣RT-PCR擴增結果

利用ToCVHSP70 基因的2對特異引物 HSP1-F/R 和 HSP2-F/R 分別進行RT-PCR擴增,從6份番茄病樣總RNA中均能擴增到1條與預期大小一致的特異片段,長度分別為943 bp和913 bp,而健康番茄樣品中未擴增出任何片段(圖1)。

2.2HSP70 基因序列分析

PCR產物測序結果表明,引物HSP1-F/R擴增獲得的943 bp片段和引物HSP2-F/R擴增獲得的913 bp片段與設計預期相符;兩片段3′端和5′端有70 bp序列相同,采用軟件SeqMan對這兩個片段序列進行拼接獲得1 785 bp序列,其中包含有一個長度為1 665 bp的完整ORF。由此得出,廣東番茄分離物GD01的HSP70全長為1 665個核苷酸(GenBank登錄號:KT962275),編碼554個氨基酸。BLAST結果顯示,與該基因序列有較高同源性的序列均為ToCV分離物的HSP70基因,其氨基酸序列與ToCV各分離物的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。進一步比較(表1)顯示,該基因序列與來自塞浦路斯、約旦、烏拉圭、古巴、土耳其、留尼旺島、韓國、西班牙、美國、希臘、日本、巴西及中國等的22個ToCV分離物的序列同源性均在79%以上,其中與塞浦路斯tomato和約旦JU_20 分離物的同源性最高,為81.8%:與中國河北、山東、江蘇、河南等分離物的同源性為80.2%～80.5%。這些結果表明,廣東番茄受到了ToCV侵染,但所研究的GD01分離物HSP70基因與已報道分離物存在一定的差異。

為了分析分離物GD01與已報道各ToCV分離物的HSP70親緣關系,選取了來自我國不同地區的7個分離物以及12個國家的15個ToCV分離物,以同屬的番茄侵染性褪綠病毒Tomatoinfectiouschlorosisvirus西班牙TICV-SP5131分離物(FJ542305)為外組構建系統進化樹(圖2)?？梢钥闯?分離物GD01與來自中國不同地區的7個分離物及國外的15個ToCV分離物聚集在一個大的分支上,但獨立在一個小分支上,說明廣東番茄分離物GD01與已報道的ToCV各分離物親緣關系相對較遠。

圖1 番茄病樣RT-PCR檢測結果Fig.1 Detection results of the diseased tomato samples using RT-PCR

病毒分離物Virusisolate地理來源GeographicoriginGenBank登錄號Accessionno.同源性/%IdentityToCV-tomato塞浦路斯CyprusAM15895881.8ToCV-JU_20約旦JordanKP71334981.8ToCV-CRS07烏拉圭UruguayKC62601981.7ToCV-CCu古巴CubaFJ36085381.6ToCV-Fethiye土耳其TurkeyEU06936381.5ToCV-Reunion1留尼旺島ReunionAJ96839481.2ToCV-JJ韓國SouthKoreaKP13710180.7ToCV-AT80/99西班牙SpainDQ13614680.5ToCV-SDTADP中國ChinaKC81262480.5ToCV-SDLC中國ChinaKC81262680.4ToCV-SDSG中國ChinaKC70951080.4ToCV-Handan中國ChinaKM65582980.4ToCV-HBLF中國ChinaKP21720280.4ToCV-Florida美國USAAY90344880.4ToCV-Gr-535希臘GreeceEU28474480.4ToCV-HP韓國SouthKoreaKP11453780.4ToCV-IS29韓國SouthKoreaKP11452980.4ToCV-Tochigi日本JapanAB51344280.4ToCV-Nanjing中國ChinaKJ81504580.3ToCV-HNZZZM2中國ChinaKP26498880.2ToCV-ToC-Br2巴西BrazilJQ95260180.2ToCV-FL47美國USAHQ87984579.5

圖2 基于HSP70基因核苷酸序列構建的GD01與其他22個ToCV分離物的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of GD01 and other 22 isolates of ToCV based on the nucleotide sequences of HSP70 gene

3 討論

本研究采用擴增長線形病毒科病毒最保守蛋白之一HSP70的2對特異引物 HSP1-F/R 和 HSP2-F/R 對廣東省疑似ToCV侵染的番茄病樣進行RT-PCR檢測,檢測結果顯示該批病樣中確實存在ToCV,并獲得了廣東番茄分離物GD01的HSP70的全基因序列。序列分析顯示,分離物GD01的HSP70氨基酸序列與GenBank登錄的ToCV的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。根據目前國際病毒分類委員會第九次報告公布的分類方案[27],確定侵染廣東番茄的病毒分離物GD01屬于ToCV的一個分離物,這是首次在廣東省檢測到該病毒。

ToCV廣東番茄分離物GD01的HSP70基因序列與塞浦路斯ToCV-tomato、約旦ToCV-JU_20 分離物同源性最高,但僅為81.8%,而與中國其他地區分離物同源性最高為80.5%;中國已報道的ToCV各分離物的HSP70基因序列同源性均在99%以上,系統進化樹分析顯示ToCV所有分離物聚集在一個大的分支上,但分離物GD01獨立在一個小分支上。由此可見,ToCV廣東番茄分離物GD01與國內外已報道的分離物存在差異較大。推測造成這種差異的原因可能與病毒的地理分化有關,也有可能與傳毒介體不同有關。無論是哪種原因占主導,本研究結果一方面說明危害我國的ToCV種群存在遺傳多樣性,另一方面揭示了我國粉虱傳病毒的復雜性,這些都將為粉虱傳病毒的重組、變異與流行提供條件,需要加強對其進行監測。

由ToCV侵染引起的番茄褪綠病毒病是我國近年暴發的一種新病害,目前已在河北、山東等黃河中下游番茄產區暴發和流行。例如,2013年山東省大面積暴發番茄褪綠病毒病,部分溫室發病株率20%～100%,造成番茄減產10%～40%[22]。該病毒病也在江蘇和臺灣發生,但在華南地區還未見報道。ToCV可以侵染多種植物,我國目前已報道的寄主有番茄[4,23-26]、甜椒[21]和茄子[28-29]3種作物。這3種作物在廣東省種植非常廣泛,幾乎遍及各個蔬菜產區;此外,傳播介體粉虱在廣東省常年普遍發生,一旦發生 ToCV,極有可能通過粉虱或種苗調運造成大面積暴發和流行。本研究首次在廣東番茄產區發現了番茄褪綠病毒病,目前僅零星發生,應引起有關部門和生產者的重視。

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(責任編輯：楊明麗)

Molecular identification ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato in Guangdong Province

Tang Yafei1,2, He Zifu1,2, She Xiaoman1, Lan Guobing1

(1.PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640,China;2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

A new disease on tomato recently occurs in Guangdong Province. The symptoms of the diseased tomato plants include leaf chlorotic, vein dark-greening and leaf thickening. The expected DNA fragments were amplified from all 6 diseased samples with two specific primer pairs forHSP70 gene ofTomatochlorosisvirus(ToCV) by RT-PCR. And a full length ofHSP70 (1 665 bp) was obtained by sequencing, which shared high nucleotides identity with those from other ToCV isolates. The result indicated that the collected tomato samples have been infected by ToCV in Guangdong. But there exists great difference in nucleotide sequence ofHSP70 between the isolate from Guangdong (GD01) and other ToCV isolates from all over the world. The nucleotide sequence ofHSP70 from isolate GD01 shared the highest identity (81.8%) with isolate tomato from Cyprus and JU_20 from Jordan. This paper was the first report on the occurrence of ToCV in Guangdong, and also the first report of significant difference in nucleotide sequence ofHSP70 between ToCV GD01 and other isolates.

tomato viral disease;Tomatochlorosisvirus;HSP70 gene

2016-04-20

2016-06-27

公益性行業(農業)科研專項(201303028);廣東省科技計劃項目(2014B070706017,2015A020209070)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.022

Research Notes

* 通信作者 E-mail:hezf@gdppri.com