大豆炭疽病菌Colletotrichumchlorophyti的鑒定

李海云, 靳 帥, 張學勤, 范光輝, 張建新, 許艷霞

(河北出入境檢驗檢疫局京唐港辦事處, 唐山 063611)

大豆炭疽病菌Colletotrichumchlorophyti的鑒定

李海云*, 靳 帥, 張學勤, 范光輝, 張建新, 許艷霞

(河北出入境檢驗檢疫局京唐港辦事處, 唐山 063611)

從進口的烏拉圭大豆的殘留莖稈上分離到一種新的大豆炭疽病菌,根據菌落形態、分生孢子形態、ITS序列及ACT序列特征以及對大豆的致病性,將其鑒定為Colletotrichumchlorophyti,這是我國口岸首次截獲該菌。

大豆; 炭疽病菌; 分離; 鑒定

炭疽菌ColletotrichumCorda是重要的世界性植物病原真菌。由該屬一些種引起的大豆炭疽病在巴西、印度、南美及中國臺灣及內地普遍發生,導致大豆減產16%～100%[1-3]。該病從苗期至收獲期均可發病,苗期引起大豆死苗,成株期可危害莖稈、豆莢,導致大豆品質變劣,產量下降。據報道,能夠引起大豆炭疽病的病原菌有平頭炭疽菌C.truncatum、毀滅炭疽菌C.destructivum、毛核炭疽菌C.coccodes、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides及禾谷炭疽菌C.graminicola[4-6]。美國科學家于2009年從阿拉巴馬州、伊利諾伊州及密西西比州大豆葉柄中首次分離得到C.chlorophyti,2012年報道該菌侵染大豆,引起大豆炭疽病,隨后2013年發現該菌可以侵染大豆種子[7-8]。但目前國內尚未有該菌分布的報道,口岸亦沒有相關截獲報道。

2015年9月,我們在對進境烏拉圭大豆進行檢疫時,發現類似炭疽病癥狀的豆稈,經實驗室分離培養、形態和分子特征鑒定及致病性測定,確認該菌為Colletotrichumchlorophyti,這是我國首次截獲并報道該病菌。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

從烏拉圭進境大豆中,選取有病斑或表面帶小黑點等可疑癥狀的莖稈及豆莢,1.25%次氯酸鈉表面消毒10 min,無菌水洗3 次,置于PDA 平板上,25℃、12 h光暗交替培養,3 d后觀察豆莢、莖稈周圍是否有菌落產生,并將菌絲移入新的PDA培養基上進行純化培養。

1.2 分離物鑒定

1.2.1 形態鑒定

將病菌分離物置于PDA培養基上,25℃培養3 d后觀察菌落形狀及色澤,取菌絲制片觀察和成像。顯微鏡下觀察記錄厚垣孢子和分生孢子形態特征。

1.2.2 分子鑒定

將病菌分離物菌絲塊移至PDA上,25℃培養7 d后收集菌絲,液氮冷凍后研磨。取0.1 g菌絲粉用植物基因組提取試劑盒(Tiangen BioTech)提取DNA。用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ACT512F(5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′)/ACT783R(5′-TA-CGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′)[9]分別擴增 ITS和ACT基因序列。PCR反應總體積為50 μL:25 μLTaqPCR Mastermix(Tiangen BioTech),1 μL上游引物(10 μmol/L),1 μL下游引物(10 μmol/L),2 μL模板DNA,加水至50 μL。反應循環程序為:94℃ 4 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個循環;最后 72℃ 10 min。取 5 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統分析。PCR產物送北京金唯智生物科技有限公司測序,所得序列經核實后,去除引物序列在GenBank中進行BLAST分析。將獲得序列與GenBank中其他炭疽菌屬相關序列,用MEGA 5.0程序進行比對,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統進化發育樹,進行1 000次重復抽樣計算各節點的置信度。

1.3 致病性測定

1.3.1 莖稈傷口接種

取烏拉圭進口轉基因大豆種子(GTS40-3-2品系及MON87701×89788品系)種植于營養土中,25℃光照條件下培養4周備用。在菌齡1周的培養皿中加入5 mL滅菌水,振蕩,獲得濃度約為107cfu/mL的分生孢子懸浮液。在大豆幼苗下胚軸劃一傷口,針刺接種分生孢子懸浮液，3次重復，每次至少接種5株幼苗，從無菌水作對照接種,接種后置于密封塑料袋中25℃保濕培養1 d,1～2周內觀察記錄發病癥狀。

1.3.2 葉片傷口接種

取健康大豆種子‘中黃13’種植于營養土中,25℃光照條件下培養4周備用。在菌齡1周的培養皿中加入5 mL滅菌水,獲得濃度約為107cfu/mL的分生孢子懸浮液。采用針刺法接種幼葉,重復3次,每次至少接種5株幼苗，25℃保濕培養1 d,1～2周內觀察記錄發病癥狀,對照用無菌水接種。1～2周后將接菌的莖稈和葉片經表面消毒后再分離病菌。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態鑒定

在PDA培養基上,分離物菌落圓形,氣生菌絲氈狀或絨狀,緊貼培養基生長,菌落邊緣整齊,呈灰白色,培養3 d后菌絲開始變黑,10 d后黑色菌落滿皿(圖1a～b)。培養3 d后開始產生厚垣孢子,厚垣孢子單生或串生于菌絲頂端或中間,黃褐色至黑褐色,多數球形,光滑,大小(平均)7.5 μm×7.5 μm。分生孢子單胞,無色,新月形或鐮刀狀,一端尖銳,另一端較鈍,大小(平均)19 μm×4.8 μm(圖1c～d),無附著胞產生。

圖1 Colletotrichum chlorophyti分離物形態特征Fig.1 Morphology of Colletotrichum chlorophyti

2.2 分子生物學鑒定

2.2.1 ITS序列分析

利用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4對分離物基因組DNA進行PCR擴增,通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,PCR產物送北京金唯智生物科技有限公司測序,獲得538 bp序列 (GenBank登錄號:KU594267)。將序列在NCBI網站進行Blastn比對分析,發現序列與Colletotrichumchlorophyti(KT207464,KR052084,KC790962,JX126475,KC110786,NR_111460,GU227894和GU227895)的序列相似性為100%。與C.truncatum(DQ195714和DQ195715)的序列相似性為100%,與C.phaseolorum(NR_119771和GU227896)的序列相似性為99.21%,與C.metake(AB738859)的序列相似性為99.92%,說明分離物與C.chlorophyti和C.truncatum的親緣關系較近。

2.2.2 ACT序列分析

為進一步明確分離物的種群分類地位,以actin為內參基因進行序列分析。采用引物ACT512F/ACT783R對分離物基因組DNA進行PCR擴增及測序,獲得215 bp序列(GenBank登錄號:KU985441),并進行BLAST分析。結果表明,分離物與GenBank中C.chlorophyti(KC110822,JX126476,GU227993和GU227992)序列相似性為99.03%～100%,與C.phaseolorum(GU227994和GU227995)的序列相似性為88.52%～89.52%,與C.truncatum(GU227960)的序列相似性為71.90%。采用MAGA 5.0軟件進行系統發育關系分析,發現分離物與C.chlorophyti在一個分支,且Bootstrap支持率為100%(圖2)。

圖2 基于ACT序列采用NJ法構建的系統發育樹Fig.2 A phylogenetic tree resulted from analysis of the ACT sequences by using the NJ method

2.3 致病性測定

將分離物接種大豆幼苗均可使植株發病,發病率為100%。接菌幼苗莖稈2周后,接種處產生潰瘍斑,對照植株除接種處變褐外,無潰瘍斑(圖3a)。針刺接種葉片5 d后,在接種處產生明顯的壞死斑,病斑周圍深褐色,中央淺褐色,對照葉片僅接種處有傷口,未變色(圖3b)。根據柯赫氏法則,對發病植株和對照株進行病原菌分離,所有發病部位均分離得到與接種菌菌落形態一致的分離物,而對照植株上沒分離到接種菌(圖3c)。

圖3 病原分離物的致病性測定Fig.3 Pathogenicity test of pathogenic isolate

通過病原菌的形態學鑒定、致病性測定和分子生物學分析結果,我們將分離物鑒定為C.chlorophyti。

3 討論

自2012年,Yang等首次報道C.chlorophyti能夠侵染大豆[7],引起大豆炭疽病以來,我國口岸尚沒有該菌的截獲報道。本研究對進境大豆莖稈上的病菌分離物進行鑒定,結果發現該分離物與C.chlorophyti一致。

傳統的炭疽菌屬分類主要依靠形態學特征,包括分生孢子和附著胞的大小和形狀,剛毛和菌核的有無,菌落顏色,生長速度,培養條件等[4,10]。然而,在環境影響下,炭疽菌屬真菌在形態及表型上存在差異,形態學特征并不能充分區別各菌種。隨著分子生物學的發展,免疫學方法、隨機擴增DNA多態性(randomly amplified polymorphic DNAs,RAPDs)、rDNA-ITS技術等已經廣泛用于炭疽菌的鑒定。然而,采用真菌公認的DNA條形碼基因核糖體內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)不能充分地區分炭疽菌屬內各物種,目前,actin(ACT)、β-tubulin(TUB2)、calmodulin(CAL)、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDH)及rDNA-ITS(ITS)5對基因已用于炭疽菌屬的種群鑒定[11]。本研究中選取ITS和ACT兩個基因進行分子鑒定,結果顯示ITS序列不能有效區分C.chlorophyti和C.truncatum,在ACT序列的聚類圖中,分離菌與C.chlorophyti在一個分支上,且自展支持率為100%。因此,綜合形態及分子鑒定結果,可以確定該分離物為C.chlorophyti。

迄今,大豆炭疽病的病原菌報道最多的是C.truncatum,而多個炭疽菌種通常可以侵染同一寄主[12],因此,每種病菌的致病作用不可忽視。目前,國內外對C.chlorophyti的研究報道極少,僅有該菌侵染大豆及其qPCR分子檢測方面的報道。我國是重要的大豆進口國,病害隨進口傳播與擴散的風險極高, 因此,下一步將對大豆炭疽病菌C.chlorophyti的生物學特性、致病性分化、快速檢測及有效防治等進行詳細研究,為該菌的檢疫及病害防治提供理論指導。

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(責任編輯：楊明麗)

Identification ofColletotrichumchlorophyticausing soybean anthracnose

Li Haiyun, Jin Shuai, Zhang Xueqin, Fan Guanghui, Zhang Jianxin, Xu Yanxia

(JingtangPortOfficeofHebeiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Tangshan063611,China)

The pathogenic fungus isolated from soybean imported from Uruguay was identified asColletotrichumchlorophytibased on the morphological characteristics of the colony and conidia of the fungus, rDNA-ITS and partial sequence of the actin gene, and its pathogenicity to soybean. It was the first report thatColletotrichumchlorophytiwas imported to China.

soybean;Colletotrichumchlorophyti; isolation; identification

2016-03-28

2016-05-13

S 41-30

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.028

致 謝： 本研究得到上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心易建平研究員的悉心指導與大力幫助，特此致謝。

* 通信作者 E-mail:yousliyun@163.com