功能失調性子宮出血育齡期女性生殖激素水平、MMP-9及TIMP-1的變化及其意義

溫云花　葛菲　符愛貞　周冰

功能失調性子宮出血(dysfunctional uterine bleeding，DUB)是臨床上較為常見的婦科急癥，流行病學研究顯示，DUB的發病率呈現出了一定的上升趨勢，可達0.05%以上[1]。DUB導致的月經量及月經周期的紊亂，嚴重影響患者的生活質量。神經-內分泌機制紊亂及下丘腦-垂體-卵巢軸的調節異常，是促進DUB發生、發展的主要因素。但近年來基礎研究顯示，子宮內膜局部微環境中的相關因子的改變，同樣可以加劇DUB患者的癥狀，促進DUB的發生[2]。雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progestrogen，P)可以影響子宮內膜的周期性改變，而基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP-1)可以通過損傷子宮內膜血管內皮層，加劇DUB出血癥狀[3]。本研究選取2012年1月—2015年1月在本院婦產科診治的49例育齡期DUB患者，探討DUB育齡期婦女生殖激素水平、MMP-9、TIMP-1的表達變化及意義，報道如下。

對象與方法

1.對象：選取2012年1月—2015年1月在海口市婦幼保健院婦產科診治的育齡期DUB患者49例(DUB組)、月經周期正常的健康女性20例(對照組)。DUB組年齡21～41歲，平均(29.8±5.1)歲；已婚32例，未婚17例；體質量指數(BMI)(23.1±1.8)kg/m2。對照組年齡21～41歲，平均(29.4±5.5)歲；已婚12例，未婚8例；月經周期26～30 d，平均(28.2±1.2)d；BMI為(22.9±2.0)kg/m2。兩組年齡、婚姻狀況、BMI比較，差異均無統計學意義。

納入標準為(1)DUB患者的診斷標準參考美國婦產科協會制定的標準[4]；(2)DUB組3個月內均未使用過激素、避孕藥物及避孕器具；(3)對照組為因男方因素導致不孕，準備接受人工受精的婦女；(4)所有納入患者均為排卵性子宮出血；(5)本研究獲得研究對象的知情同意，并簽署保密協議。

排除標準：(1)近3個月內服用激素類藥物、避孕類藥物或使用避孕器械的患者；(2)患有全身系統性疾病；(3)患有生殖道感染性疾病；(4)患有生殖道腫瘤；(5)患有妊娠并發癥或異常妊娠；(6)有精神緊張、恐懼、憂傷、情緒不穩定、焦慮、抑郁者。

2.免疫組化檢測方法:采用石蠟切片，切片厚度3 mm，室溫下用3% H2O2孵育5 min，應用去離子水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 ml純水)封閉，室溫孵育5 min，加入MMP-9、TIMP-1抗體(鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測公司)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入NBT/BCIP色劑顯色5 min，復染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。

3.免疫組化評分標準：MMP-9和TIMP-1陽性著色主要表達于細胞漿、細胞核中，呈黃色、淡黃色、棕色、褐色顆粒表達；在高倍光鏡下隨機選取5個視野進行陽性細胞計數和觀察。(1)根據著色強度，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色、黑色；(2)根據陽性細胞比例，陽性細胞數目所占比例<10%為1分，陽性細胞所占比例11%～50%為2分，陽性細胞數51%～75%為3分，陽性細胞數所占比例>75%為4分，兩種積分相乘總分<3分為陰性、≥3分為陽性。

3.血清中的E2及P標本采集及檢測：清晨空腹采集靜脈血(診刮術術前24 h)，按照10 000 r/min的離心速度對血清進行離心分離，-20 ℃保存待測，采集標本后1周內檢測E2、P，采用瑞士羅氏全自動生化分析儀E170模塊進行檢測，檢測試劑盒購自上海泰康生物科技有限公司。具體檢測方法參照試劑盒說明書，試劑盒內配有質控血清或質控標準品，所有操作嚴格按照操作說明完成。

4.子宮內膜組織中的E2及P標本采集及檢測：診斷性刮宮過程中刮取的子宮內膜組織，采用組織研磨法進行研磨，加入細胞裂解液，采用去離子水作為陰性對照，采用50 μl cryab作為陽性對照，平衡搖晃20 s混勻，室溫下孵育2 h，采用TBSP緩沖液清洗3次，每次5 min，加入100 μl底物，平衡搖晃30～45 s，25℃室溫下孵育40 min，加入250 μl終止物，直到96孔板中每孔的顏色變黃，最后以空白對照為基準，采用分光光度計進行讀數。應用ELISA法檢測E2、P。E2、P等抗體購自羅氏檢測公司，相關配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司，嚴格按照說明書的要求進行操作。

結果

1.兩組血清生殖激素水平比較：DUB組和對照組的血清E2、P水平比較，差異均無有統計學意義，見表1。

表1　兩組血清生殖激素水平比較

2.兩組子宮內膜E2、P表達水平比較：DUB組子宮內膜中E2表達水平顯著高于對照組，P表達水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義，見表2。

表2　兩組子宮內膜E2、P表達水平比較值)

注：兩組比較，*P<0.05

3.兩組子宮內膜MMP-9、TIMP-1表達水平比較：DUB組子宮內膜腺體和間質中MMP-9表達水平顯著高于對照組，DUB組子宮內膜腺體和間質中TIMP-1表達水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義，見表3，圖1、2。

表3　子宮內膜MMP-9、TIMP-1表達水平比較分)

注：*P<0.05

4.DUB組子宮內膜MMP-9、TIMP-1表達與子宮內膜E2、P表達水平的關系：DUB組子宮內膜腺體和間質中MMP-9與E2表達水平呈正相關(r=0.411、0.502，P<0.05)，腺體和間質中TIMP-1表達與E2表達呈負相關(r=-0.368、-0.407，P<0.05)；DUB組子宮內膜腺體和間質中MMP-9、TIMP1與子宮內膜中P的表達水平無相關性。

討論

1.DUB的流行病學研究：性激素分泌紊亂、多次人工流產病史等，均可以促進DUB的發生、發展，特別是在具有慢性盆腔炎癥性疾病病史的人群中，DUB的發病率更高，可較普通人群上升3～4倍[5]。臨床上DUB的長期進展可以導致子宮內膜不典型增生等傾向惡性病變的發生，同時可以導致月經量增多引起的嚴重貧血，危及生命。現階段，臨床上主要采用診斷性刮宮進行DUB的診斷和治療，但刮宮聯合術后進行雌孕激素治療的臨床總體有效率較低，不足45%[6-7]。而通過對DUB發生、發展過程中相關生物學機制的研究，可以為DUB的治療提供理論依據，進而提高其臨床治療效果。

2.E2及P的改變對于DUB的影響：子宮內膜的增生期、分泌期過程中性激素水平的穩定對于維持正常的月經周期及月經量具有重要的意義。E2可以促進子宮內膜的增生期持續性改變，而P可以在增生期改變的基礎上誘導子宮內膜呈現分泌期改變，促進子宮內膜的正常脫落。有國內外相關研究認為，DUB患者血清中或者子宮內膜局部組織中的E2及P的表達紊亂，可以促進DUB患者子宮內膜異常脫落，進而導致DUB患者發生反復出血[8]，但相關研究的樣本量較少，臨床資料的收集偏倚較為嚴重，可信度不高。

3.MMP-9及TIMP-1的改變與DUB的關系：MMP-9可以通過激活細胞間質中的纖維蛋白分解酶原，進而促進膠原纖維的分解和代謝，并調控局部組織的炎癥損傷、細胞修復等，特別重要的是，MMP-9可以促進子宮內膜間質成分的分解，誘導子宮內膜血管的損傷，加劇內膜出血；TIMP-1作為MMP-9的特異性抑制物，在穩定MMP-9活性的同時，還可避免過度激活MMP-9[9]。本研究的創新性在于探討了子宮內膜局部組織中的TIMP-1及MMP-9等的表達，揭示了子宮內膜局部微生態環境改變對于DUB的影響。

4.子宮內膜局部組織中TIMP-1及MMP-9等指標的變化分析：本研究發現，在DUB患者血清中并不存在明顯的E2及P的改變，DUB及正常對照人群的E2及P表達無差異，考慮雌激素或者孕激素上調導致的子宮內膜相關性激素受體的激活，并不會促進子宮內膜的不規則脫落，不會引起異常子宮出血或者功能失調性出血的發生。通過對比分析子宮內膜組織中E2及P的定量表達可以發現，DUB患者局部子宮內膜組織中的E2表達強度較高，而P的表達強度較低，E2的高表達可以促進子宮內膜的增生期改變，而P表達的下降使得子宮內膜的分泌期變化減弱，子宮內膜的不同時期的變化失去了其原有的平衡。石曉敏等[10]和薛薇等[11]通過回顧性分析了39例DUB患者的臨床資料，采用蛋白定量檢測技術分析了E2及P的表達，發現E2可較正常女性上升25%以上，表達強度明顯上升，這與本研究的結論較為一致。免疫組化切片分析可見，MMP-9主要表達于子宮內膜腺體的周邊，TIMP-1主要表達于細胞間質中，特別是在血管周邊，MMP-9及TIMP-1的表達強度更高，提示二者的表達可能與影響子宮內膜局部組織中的血管生理功能有關。同時本研究也發現，MMP-9及TIMP-1的表達同樣呈現出了一高一低的趨勢，MMP-9的相對表達過多促進內膜血管的分解和破壞，促進了子宮異常出血的發生，二者可能在促進子宮內膜剝脫或者增生性修復過程中發揮了一定的協同作用，但具體的機制仍然需要后續研究的進一步證實。但需要注意的是，Shirota等[12]、Nouri等[13]和Jain等[14]并未發現DUB患者子宮內膜組織中TIMP-1的表達下降，這與本研究的結論存在一定的差別，考慮認為與樣本量的不足、檢測方法的不同等有關，這均可能導致研究結論的差別。

綜上所述，DUB患者子宮內膜局部組織性激素表達的改變，以及MMP-9與TIMP-1平衡的打破，可能是促進DUB發生、發展的重要因素。臨床上可以通過檢測子宮內膜組織中的MMP-9等的表達變化，進而為評估病情的遠期預后提供一定的參考。本研究的局限性在于未能探討DUB患者治療轉歸過程中MMP-9等指標的動態變化，存在一定的不足。

(圖1、圖2見封三)

1黃穎，高波，李玲.兩種方法治療青春期功能失調性子宮出血98例臨床療效分析.海軍醫學雜志,2016,25:170-172.

2王國建.功能失調性子宮出血發病機制和治療進展.世界最新醫學信息文摘,2015,25:129-130.

3劉書言，武斌，陳西華，等.ROS調控MMPs對子宮內膜崩解的作用.基因組學與應用生物學,2015,22:12-16.

4王名芳，馬潤玫.美國婦產科醫師學會“婦產科臨床緊急準備(2014)”共識解讀.中華產科急救電子雜志,2015,24:162-165.

5袁會英.功能失調性子宮出血316例臨床表現分析.云南醫藥,2016,32:306-308.

6Learman LA,Nakagawa S,Gregorich SE,et al.Success of uterus-preserving treatments for abnormal uterine bleeding,chronic pelvic pain,and symptomatic fibroids:age and bridges to menopause.Am J Obstet Gynecol,2011,204:271-272.

7Kim TH,Lee HH.Reply:Methods of holding the cervix and applying compression based on uterine bleeding:caudal or cephalad to the uterus.Acta Obstet Gynecol Scand,2014,93:315-316.

8Klenske J,Knoll M,Kornovski Y.[Global ablation of endometrium as a new uterus sparing operative method in uterine dysfunctional bleeding].Akusherstvo I Ginekologiia,2013,25:90-92.

9高紅艷，陳繼明，劉芳，等.TGF-β1對小鼠子宮內膜基質細胞MMP-9表達的影響.重慶醫學,2015,42:5054-5056.

10石曉敏，吳春寒，魏瑋，等.459例育齡期婦女異常子宮出血病理分析.中國當代醫藥,2016,25:95-97.

11薛薇，孫愛軍.性激素在圍絕經期異常子宮出血中的作用機制.中國實用婦科與產科雜志,2012,22:742-744.

12Shirota M,Kawashima J,Nakamura T,et al.Vascular hamartoma in the uterus of a female Sprague-Dawley rat with an episode of vaginal bleeding.Toxicol Pathol,2013,32:90-93.

13Nouri M,Tavakkolian A,Mousavi SR.Association of dysfunctional uterine bleeding with high body mass index and obesity as a main predisposing factor.Diabetes Metab Syndr,2014,8:1-2.

14Jain S,Vaid NB,Narang Y,et al.A Randomised Controlled Trial Comparing the Efficacy and Side-Effects of Intravaginal Ring (Nuvaring(?)) With Combined Oral Hormonal Preparation in Dysfunctional Uterine Bleeding.J Clin Diagnos Res,2016,10:21-23.