利濕活血方對高尿酸血癥大鼠血尿酸及抗氧化能力的影響

吳 麗 王林元 劉 暢 王小花 王成龍 王 淳 張建軍

(北京中醫藥大學，北京，100029)

實驗研究

利濕活血方對高尿酸血癥大鼠血尿酸及抗氧化能力的影響

吳 麗 王林元 劉 暢 王小花 王成龍 王 淳 張建軍

(北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：探討中藥利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血尿酸及其抗氧化能力的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機分成空白組、模型組、四妙丸組、苯溴馬隆組及利濕活血方(7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg)組，共7組。除空白組，其余各組以酵母膏、腺嘌呤連續灌胃14 d，制備高尿酸血癥模型。驗模成功后，各給藥組灌胃給予相應藥物，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，連續14 d。末次給藥后，測定大鼠血清中血尿酸(UA)、丙二醛(MDA)含量,活性氧簇(ROS)水平及過氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)的活性。結果：1)與空白組比較，模型組動物血清UA含量升高，差異有統計學意義(P<0.001)；ROS水平升高，差異有統計學意義(P<0.001)；MDA含量顯著升高(P<0.01)；SOD、T-AOC活性明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)。2)與模型組比較，四妙丸組、苯溴馬隆組及利濕活血方7.74 g/kg、3.87 g/kg組大鼠血清UA含量明顯降低，苯溴馬隆組、利濕活血方7.74 g/kg組差異有統計學意義(P<0.001、P<0.01)；苯溴馬隆組、利濕活血方7.74 g/kg組MDA含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)；除四妙丸組外，各給藥組SOD活性較模型組均顯著升高(P<0.001)；各給藥組ROS均降低，苯溴馬隆組差異有統計學意義(P<0.001)，利濕活血方7.74 g/kg、3.87 g/kg組差異有統計學意義(P<0.01)；四妙丸組、苯溴馬隆組及利濕活血方7.74 g/kg、3.87 g/kg組大鼠血清T-AOC活性明顯升高，苯溴馬隆組差異有統計學意義(P<0.001)，利濕活血方7.74 g/kg組差異有統計學意義(P<0.01)。結論：中藥利濕活血方從濕熱壅盛、瘀血阻滯的病機出發，以清熱利濕、化瘀散結為治法，在降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸的同時，還能增強高尿酸血癥大鼠的抗氧化和清除氧自由基的能力，減少脂質過氧化，達到較好的治療效果。

高尿酸血癥；抗氧化；UA；MDA；SOD；ROS；T-AOC；利濕活血方

高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)是血液中嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的一種代謝性疾病[1]。尿酸是重要的內源性抗氧化物質[2]。但也有研究表明尿酸參與氧化應激反應。課題組針對高尿酸血癥屬于濕熱濁瘀蘊阻的病機，結合臨床用藥經驗創制利濕活血方，前期研究證實其具有確切的降低高尿酸血癥模型大鼠血清尿酸的作用。我們旨在研究利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠抗氧化能力的影響。通過復制高尿酸血癥模型，觀察實驗動物血清血尿酸(UA)、丙二醛(MDA)含量，活性氧簇(ROS)水平及過氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)的活性，探討中醫清熱利濕、活血散結之治法對高尿酸血癥模型大鼠抗氧化和清除氧自由基的能力的影響，為臨床治療高尿酸血癥及其并發癥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 利濕活血方，由北京中醫藥大學基礎醫學院臨床中藥室制備，本方由金錢草、土茯苓、粉防己、黃柏、萆薢、三七、川牛膝、赤芍、青風藤等組成，其中金錢草、土茯苓、萆薢、川牛膝、赤芍用水提取，粉防己、黃柏、三七、青風藤用乙醇提取；四妙丸，6 g/袋，吉林紫馨藥業股份有限公司，批號130810；苯溴馬隆片/立加利仙，50 mg/片，生產企業為德國赫曼大藥廠，生產批號1207036；酵母膏，國藥集團化學試劑有限公司，生產批號20140216；腺嘌呤，國藥集團化學試劑有限公司，生產批號20140901；UA試劑盒，中生北控股份有限公司，生產批號150729；MDA、SOD、T-AOC、GSH-PX、CAT試劑盒,北京華英生物技術研究所，生產批號20151228；ROS試劑盒，南京建成生物工程研究所，生產批號151016。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體重(250±10)g，周齡8周，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2014-0006。

1.3 實驗儀器 日本日立7160全自動生化儀；紫外分光光度儀：UV-7504pc；臺式高速冷凍離心機Neofuge15R：Heal Force。

1.4 動物分組及處理 取70只雄性SD大鼠，適應性飼養7 d后(室溫16～22 ℃，濕度65%～70%，自由進食飲水)，隨機均分成分成空白組、模型組、四妙丸組、苯溴馬隆組及利濕活血方7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg組共7個組。除空白組外，其余6組給予酵母膏10 g/(kg·d)、腺嘌呤100 mg/(kg·d)連續灌胃14 d，以制備高尿酸血癥大鼠模型。驗模成功后，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，四妙丸組每天灌胃四妙丸1.6 g/kg(相當于成人每日臨床用量8倍)，苯溴馬隆組灌胃苯溴馬隆10 mg/(kg·d)(相當于成人每日臨床用量的7倍)；利濕活血方各組劑量按生藥分別為7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg(相當于成人每日臨床用量16倍、8倍、4倍)灌胃，連續14 d。

1.5 檢測指標 末次給藥2 h后，各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清，用比色法測定大鼠血清UA、MDA的含量和SOD、GSH-PX、T-AOC、CAT的活性，用化學熒光法測ROS水平。

2 結果

2.1 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清UA含量的影響 與空白組比較，模型組動物血清UA含量升高，差異有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，各給藥組血清UA明顯降低，四妙丸組差異有統計學意義(P<0.05)；苯溴馬隆組差異有顯著統計學意義(P<0.001)；利濕活血方7.74 g/kg組差異有統計學意義(P<0.01)；利濕活血方3.87 g/kg組差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清UA含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001。

2.2 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響 與空白組相比，模型組血清SOD和T-AOC的活性顯著降低(P<0.001)，而血MDA的水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，除四妙丸組外，各給藥組SOD活性均顯著升高(P<0.001)；四妙丸組T-AOC活性顯著升高(P<0.05)；苯溴馬隆組T-AOC活性顯著升高(P<0.001)；利濕活血方7.74 g/kg組T-AOC活性顯著升高(P<0.01)；利濕活血方3.87 g/kg組T-AOC活性顯著升高(P<0.05)；苯溴馬隆組和利濕活血方7.74 g/kg組的血清MDA水平，與模型組相比顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清ROS水平及GSH-PX、CAT活性的影響 與空白組相比，模型組血清ROS水平顯著升高(P<0.001)；與模型組相比，四妙丸組ROS水平顯著降低(P<0.05)；苯溴馬隆組ROS水平顯著降低(P<0.001)；利濕活血方7.74 g/kg組ROS水平顯著降低(P<0.01)；利濕活血方3.87 g/kg組ROS水平顯著降低(P<0.01)；利濕活血方1.935 g/kg組ROS水平顯著降低(P<0.05)；本實驗中，各實驗組GSH-PX的活力差異無統計學意義，且各組大鼠血清中CAT活性相比，差異無統計學意義。見表3。

表2 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001。

表3 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清ROS水平及GSH-PX、CAT活性的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001。

3 討論

尿酸是人體中一種很重要的內源性抗氧化劑[3]。但是尿酸水平持續升高可加強體內的氧化應激反應[4]。近年有研究發現尿酸對自由基的清除能力是有限的，血清尿酸水平升高可能促進氧化應激損傷增加，導致機體氧化-還原平衡系統破壞，同時高血尿酸也會導致慢性腎臟疾病、高血壓、冠狀動脈和心臟疾病、腦血管病、糖尿病等病的發生、發展[5-6]。高尿酸血癥的發生發展與機體氧化應激存在著密切關系。有研究發現血清尿酸水平升高可能促進氧化應激損傷增加，使機體抗氧化能力降低[7-8]。

正常生理條件下，機體活性氧的產生與抗氧化防御系統保持動態平衡，某些內源性或者外源性因素刺激使機體產生大量的活性氧，過量的活性氧自由基會導致細胞損傷，甚至凋亡、壞死[9-10]。機體內存在大量生物活性酶，能將體內的活性氧自由基清除，進而減少對細胞的損傷。細胞內抗氧化酶主要包括SOD、GSH-PX等，它們協同完成細胞內抗氧化作用。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用,它主要分布于線粒體基質和胞質中,此酶能清除超氧陰離子自由基(O2-)，保護細胞免受損傷,被認為是O2-的清除劑，是機體防御過氧化損害的關鍵酶之一。GSH-PX是機體的又一重要抗氧化酶，對體內的過氧化物可以發生催化還原的作用。MDA是活性氧自由基引起的脂質過氧化過程中生成的一種醛類物質，其含量反映機體過氧化程度及受活性氧自由基攻擊損傷的嚴重程度。T-AOC主要是機體防御系統非酶促體系抗氧化物質和酶促體系小分子量抗氧化物質的總和[11],其可有力的清除機體的活性氧自由基，是抗氧化系統的綜合性指標[12]。氧化應激是指機體ROS產生過多或機體抗氧化能力降低，使得氧化系統和抗氧化系統失衡，從而損傷體內的細胞和組織，導致機體急性損傷和潛在性損傷的病理過程[13]。機體ROS大量形成，導致保護細胞膜的能力下降，使細胞膜處于脂質過氧化狀態。過氧化氫作為很重要的ROS，可以穿透大部分細胞膜，使其毒性增強[14]。過氧化氫雖然不是自由基，但卻是很重要的活性氧，可以穿透大部分細胞膜，使其毒性更強。CAT可以把機體內過多的過氧化氫分解轉化，生成水和羥自由基。

中醫學認為高尿酸血癥的形成與濕濁蘊結、濁毒滯留、痰瘀互阻關系密切。課題組根據高尿酸血癥發病的病因病機特點，結合臨床用藥經驗，創制出中藥利濕活血方，其中金錢草清熱祛濕，利尿消石，與黃柏合用增強清熱除濕功效；三七與川牛膝、赤芍配伍用以活血通脈，化瘀消腫；土茯苓、粉防己、萆薢、青風藤同用，利尿除濕，通利經絡。共奏清熱利尿除濕、活血化瘀散結之功，與病機甚為合拍。前期研究證實其對高尿酸血癥模型既能降低血清尿酸，又能保護血管內皮功能及腎功能[15]。本實驗研究顯示：利濕活血方在降低高尿酸血癥模型大鼠血清尿酸的同時，能升高大鼠血清SOD和T-AOC的活性，降低ROS水平，減少MDA的含量。研究顯示，高尿酸血癥的老年男性或實驗動物中，GSH-PX含量在一定范圍內隨尿酸的含量而升高，但隨著尿酸的進一步升高，GSH-PX含量下降[16-17]。利濕活血方在影響GSH-PX和CAT方面，結果不顯著。分析原因，可能與動物血清尿酸含量未達到更高的程度有關，或與進行實驗的采血時間點有關，需進一步研究。

抗氧化是所有需氧生物體的一個必要過程，抗氧化劑的作用包括降低可能導致的細胞毒性、誘變性甚至致癌性[18-19]。綜合分析，利濕活血方能降低血清尿酸，提升高尿酸血癥大鼠的抗氧化和清除氧自由基的能力，減少脂質過氧化，對于治療高尿酸血癥及其氧化損傷引起的并發癥的防治顯示出一定的優勢，可為臨床論治提供思路和借鑒。

致謝：感謝本校基礎醫學院科研實驗中心李偉老師在實驗方面的大力幫助。

[1]徐立,時樂,趙芳,等.大鼠急性高尿酸血癥模型的復制方法初探[J].中國藥理學通報,2007,23(7):976-978.

[2]史珅,張澤生,張民,等.蘋果多酚對高尿酸血癥大鼠抗氧化能力的影響[J].現代生物醫學進展,2010,10(18):3460-3463.

[3]Ames BN,Cathcart R,Schwiers E,et al.Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant-and radical-caused aging and cancer:a hypothesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1981,78(11):6858-6862.

[4]Homayounfar S,Ansari M,Kashani KM.Evaluation of independent prognostic importance of hyperuricemia in hospital death after acute myocardial infarction[J].Saudi Med J,2007,28(5):759-761.

[5]王莉尿酸與氧化應激關系的研究進展[J]現代預防醫學,2012,39(12):3111-3112,3115.

[6]Riegersperger M，Covic A，Goldsmith D.Allopurinol,uric acid and oxidative stress in cardiorenal disease[J].Int Urol Nephrol,2011,43(2):441-449.

[7]徐玉龍,劉兆陽,丁琪.血尿酸水平與氧化應激在急性腦梗死發生中的關系探討[J].卒中與神經疾病,2010,17(1):9-11,19.

[8]Kurra V,Er?ranta A,Jolma P，et al.Hyperuricemia，oxidative stress，and carotid artery tone in experimental renal insufficiency[J].Am J Hypertens,2009,22(9):964-970.

[9]Thannickal VJ，Fanburg BL.Reactive oxygen species in cell signaling[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000,279(6):L1005-1028.

[10]Sreekumar R，Unnikrishnan J，Fu A，et al.Effects of caloric restriction on mitochondrial function and gene transcripts in rat muscle[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2002,283(1):E38-43.

[11]Grobner W,Walter S I.Treatment of hyperuricemia and gout[J].Med Monatsschr Pharm,2005,28(5):159-164.

[12]Krishnan E.Hyperuricemia and incident heart failure[J].Circ Heart Fail,2009,2(6):556-562.

[13]Xie L,Zhu X,Hu Y,et al.Mitochondrial DNA oxidative damage triggering mitochondrial dysfunction and apoptosis in high glucose-induced HRECs[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(9):4203-4209.

[14]Jiménez-Cervantes C，Martínez-Esparza M，Pérez C，et al.Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress：transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor[J].J Cell Sci,2001,114(Pt12):2335-2344.

[15]鄭媛,張建軍,王淳,等.消石利尿化瘀法對高尿酸血癥大鼠血清UA、NO、ET-1、TXB2及6-keto-PGF1a的影響[J].中醫藥學報,2015,43(1):15-18.

[16]芮磊,劉甲興.老年男性高尿酸血癥引起氧化應激和血管內皮損傷的研究[J].臨床軍醫雜志,2010,38(4):539-542.

[17]王莉,馬玲,姚華,等.單純酵母喂飼和氧嗪酸聯合酵母暴露高尿酸血癥腎病大鼠模型的建立及其抗氧化活力變化的比較研究[J].環境與健康雜志,2012,29(7):612-614.

[18]Matés JM.Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology[J].Toxicology,2000,153(1-3):83-104.

[19]Mates JM,Perez C,Blanca M.Chemical and biological activity of free radical ‘scavengers’ in allergic diseases[J].Clin-Chim-Acta,2000,296(1/2):1-15.

(2016-03-21收稿 責任編輯：張文婷)

Effects of Lishi Huoxue Forula on Blood Uric Acid and Antioxidant Capacity of Hyperuriceamia Rats

Wu Li, Wang Linyuan, Liu Chang, Wang Xiaohua, Wang Chenglong, Wang Chun, Zhang Jianjun

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To study the effects of Lishi Huoxue formula (LSHX) on blood uric acid and antioxidant capacity of hyperuriceamia rats. Methods:Male SD rats were randomly devided into 7 groups:blank group, model group, Simiao pill group, Benzbromarone group, and LSHX groups (7.74 g/kg，3.87 g/kg and 1.935 g/kg). Except the blank group, the rest groups were administered with yeast extract and adeline intragastrically for two weeks to build hyperuriceamia models. After that, drugs were administered to the rats in corresponding group, and the blank group and model group were given distilled water for 14 days. Then the levels of UA, MDA, SOD, ROS, T-AOC, GSH-PX, CAT in serum were detected. Results:1) Compared with the blank group, serum UA content of the model group increased greatly with significant difference (P<0.001). ROS level increased too (P<0.001), and also with the content of MDA (P<0.01). On the other hand, the activity of SOD and T-AOC were obviously lower with significant difference (P<0.001). 2) Compared with the model group, levels of serum UA in Simiao pill group, Benzbromarone group, LSHX 7.74 g/kg and LSHX 3.87 g/kg group were obviously lower, and the difference of Benzbromarone group and LSHX 7.74 g/kg group was statistically significant (P<0.001,P<0.01). The MDA content of Benzbromarone group and LSHX 7.74 g/kg group were significantly lower than that of the model group, with significant difference (P<0.05). Except Simiaowan group, the SOD activity of the other groups was obviously higher, with significant difference (P<0.001). Besides, the ROS level of each drug group decreased, Benzbromarone group (P<0.001), LSHX 7.74 g/kg and 3.87 g/kg groups (P<0.01) dropped with great significance. Serum T-AOC activity of Simiao pill group, Benzbromarone group and LSHX 7.74 g/kg and LSHX 3.87 g/kg was obviously higher than that of the model group, and the difference between Benzbromarone group and the model group was statistically significant (P<0.001), also between LSHX 7.74 g/kg and LSHX 3.87 g/kg groups and model group (P<0.01,P<0.05). Conclusion:The Chinese herbal compounds LSHX can reduce the hyperuriceamia rat′s blood uric acid, and improve antioxidant and free radical scavenging capacities in hyperuricemia rats by clearing dampness and heat and removing stasis and stagnation. The Chinese herbal compound LSHX has a great therapeutic effect.

Hyperuriceamia; Antioxidant capacity; UA; MDA; SOD; ROS; T-AOC; LSHX

國家自然科學基金項目(編號：81273632)——基于P38-NF-κB-MCP-1路徑的消石利尿化瘀法保護高尿酸血癥大鼠血管內皮功能的研究

吳麗(1990.08—)，女，碩士研究生，研究方向：中醫臨床藥學，E-mail：15811286527@163.com

張建軍(1965.08—)，女，研究員，博士研究生導師，研究方向：基于中藥基礎理論的藥效機理及物質基礎研究，E-mail：zjj59@163.com；王淳(1970.02—)，男，博士，副教授，碩士研究生導師，研究方向：中醫藥治療高尿酸血癥和痛風，E-mail：chunwang_2008@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.034