廣西豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株的分子流行病學調查及防控策略

韋柳青，邰振國，賀 銀，張淑云，戴麗敏，劉媛媛

（廣西揚翔豬病檢測中心，廣西 貴港 537100）

廣西豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株的分子流行病學調查及防控策略

韋柳青，邰振國，賀 銀，張淑云，戴麗敏，劉媛媛

（廣西揚翔豬病檢測中心，廣西 貴港 537100）

為了解廣西地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）流行毒株的遺傳變異情況和發展趨勢，通過RT-PCR方法，對2015年1-8月份采自廣西省各規模豬場的疑似樣品進行PRRSV檢測，并對陽性病料進行基因測序分析。結果顯示：84份疑似樣品中有40份檢測為陽性，陽性率為47.6%，通過完整的ORF5基因序列遺傳進化分析表明，廣西地區流行毒株主要為美洲型PRRSV，且均與高致病性PRRSV高度同源。廣西省各規模豬場毒株與2015年7月份采自廣東肇慶某規模豬場的PRRSV分離毒株間的同源性均較低，經序列對比發現，廣東肇慶分離毒株與美洲流行毒株NADC 30高度同源。結果表明，廣西地區主要流行毒株為美洲型高致病性PRRSV毒株，且與美洲流行毒株NADC30同源性較低，但廣東地區已出現美洲流行毒株NADC30，提示廣西地區需加強對PRRSV流行及變異的監測，以及采取有效防控策略的必要性。

豬繁殖與呼吸綜合征；NADC30；系統進化分析；防控

1987年，豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）首次在美國發現，以母豬流產、早產、死胎和木乃伊胎等、仔豬和育肥豬發生呼吸道疾病為主要特征，是一種急性、高度傳染性的疾病，以前曾稱為神秘病、藍耳病等，是危害養豬業最嚴重的病毒性疾病之一，現已呈世界性分布，給養豬業造成巨大的經濟損失。豬只買賣移動、飼養密度過大、飼養管理及衛生條件不良、氣候變化等，均可促發該病的流行。我國于1996年首次報道該病毒的存在，隨后流行于全國。豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的，該病毒的特點是高頻率的突變和病毒重組，導致了病毒顯著的進化和不同類型病毒的產生。目前PRRSV主要包括以VR2332毒株為代表的美洲型和以Lelystad virus（LV）為代表的歐洲型，這兩種基因型的核苷酸序列大約有40%的差異性，我國大陸流行的病毒株主要為美洲型PRRSV。

PRRSV NADC30是2008年從美國愛荷華州暴發呼吸系統疾病的豬群中分離出來的毒株，毒力較強，豬感染NADC30后快速產生病毒血癥，其表現為早期高燒和顯著的呼吸系統疾病。在我國，周峰等通過RT-PCR方法，首次從2012-2013年采自河南省各地的疑似病料中檢測到與美洲流行毒株NADC30高度同源的病毒株，說明PRRSV NADC30毒株已經傳入我國。隨后我國多地有PRRSV NADC30毒株流行的報道，2015年該毒株將進一步擴散和蔓延，如果不提前采取有效的防控策略，無疑還會有不少豬場受到感染而引發更為嚴重的疫情。我國PRRSV的變異種類更加多樣化，提示加強對PRRSV流行及變異的監測十分必要。本研究主要對2015年1-8月采自廣西各規模豬場的84份PRRSV疑似病料進行RT-PCR檢測，并對陽性樣品的的ORF5基因進行序列擴增與分析，研究廣西地區ORF5基因變異的情況和發展趨勢，為PRRS的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集廣西省貴港市、河池市、玉林市、南寧市等地各規模豬場疑似PRRSV陽性病豬的脾臟、肺臟、淋巴結等臟器以及發燒豬的血液樣品，共84份。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、鼠源反轉錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（Rnase Inhibitor）、Rrizol Reagent及瓊脂糖，均購自Invitrogen公司；dNTP、2*Taq PCR Master Mix及DNase/RNase-free去離子水，均購自北京天根公司。

表1 ORF5基因的特異性引物

表2 參考毒株

表3 檢測到的用于ORF5基因序列分析的18株PRRSV廣西毒株

圖1 18株PRRSV廣西毒株與參考毒株之間的ORF5基因核苷酸序列的遺傳進化分析

1.3 引物設計

參考中國標準株CH-1a株和已發表的HUN株全基因序列，應用Oligo 6.0生物軟件，在ORF5基因前后保守區設計一對擴增ORF5基因的特異性引物E1/E2（表1），引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.4 樣品中PRRSV的診斷和ORF5基因的序列分析

對樣品進行常規預處理后，參照病毒RNA抽提試劑盒說明書提取樣品中的RNA，經RT-PCR擴增后，反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

利用DNAStar軟件中的MegAlign程序對檢測到的部分病毒含量較高的陽性樣品的PRRSV毒株與參考毒株（表2）進行ORF5基因的序列比對、同源性分析及遺傳進化分析。

2 結果

2.1 PRRSV的診斷結果

對2015年1—8月份采自廣西各規模豬場的84份PRRSV疑似病料進行PRRSV RT-PCR檢測，結果檢出PRRSV陽性樣品40份，陽性率為47.6%。

2.2 ORF5 基因序列的擴增

選取18份病毒含量較高的陽性樣品（表3），再次進行RT-PCR擴增，擴增的基因片段長度為738 bp，PCR擴增產物直接送基因測序公司進行純化測序。

2.3 ORF5基因的核苷酸序列同源性分析

ORF5基因的核苷酸序列同源性分析顯示，18株PRRSV廣西毒株之間的ORF5基因序列同源性為93.7%～100%，與JXA1、HuN4、BJ等中國分離的美洲型高致病性參考毒株之間的ORF5基因序列同源性為94.0%～99.7%，與VR2332、R98和CH-1a等美洲型經典毒株之間的ORF5基因序列同源性為84.4%～95.2%，與歐洲型參考毒株Lelystad virus之間的ORF5基因序列同源性僅為61.6%～64.6%。18株廣西毒株與廣東肇慶毒株19-ZQLJQ之間的ORF5基因序列同源性僅為82.4%～86.1%；而廣東肇慶毒株19-ZQLJQ，與美洲型其他參考毒株之間的ORF5基因序列同源性僅為84.4%～86.9%，與美洲型NADC30之間的ORF5基因序列同源性高達95.4%。

2.4 PRRSV ORF5基因序列的遺傳進化分析

ORF5基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示，美洲型PRRSV可以分為3 個亞群（圖1），18株PRRSV廣西毒株與TJ、HuN4、JXA1等毒株組成亞群1；經典毒株VR2332、CH-1a和R98組成亞群2；廣東肇慶毒株19-ZQLJQ與2008年美國毒株NADC30同屬于亞群3。廣東毒株出現在亞群3中，預示著廣東地區已出現了新的PRRSV毒株，應當給予高度關注。

3 討論

1987年PRRSV首次暴發于美國，1996年首次證實PRRSV在我國存在，由于沒有采取有效的防治措施，2006年夏秋季節，高致病性豬藍耳病在我國南方部分地區開始暴發，現已蔓延全國。自從周峰等通過RT-PCR方法，首次從2012-2013年采自河南省各地的疑似病料中檢測到與NADC30高度同源的病毒株以來，NADC30毒株已在很多地區流行，2015年進一步擴散和蔓延。如不加以重視，美洲型毒株NADC30的傳入對中國養豬業來說可能又是1次更為沉重的打擊。

本研究中采集的病料大多來自于使用高致病性PRRS弱毒活疫苗進行免疫的豬場，也有少部分不接種PRRS疫苗的豬場。通過對豬場的持續檢測以及對PRRSV遺傳多樣性的靶基因-ORF5基因的序列分析，我們發現，豬場使用了PRRS弱毒活疫苗后，不能完全阻止PRRS的發生，雖然疾病的發生與豬場的飼養管理、免疫預防及治療等措施緊密相關，但也說明了目前市售的疫苗依然不能很好地控制豬藍耳病的發生，PRRSV還在不斷地發生變異。

值得慶幸的是，2015年1—8月監測到的18株PRRSV廣西毒株仍然屬于美洲型毒株，且均為高致病性毒株。18株PRRSV廣西毒株之間的ORF5基因序列同源性較高，與TJ、HuN4、JXA1等中國分離的高致病性毒株親緣關系較近，同屬亞群1，但與廣東肇慶毒株19-ZQLJQ之間的ORF5基因序列同源性僅為82.4%～86.1%。而廣東肇慶毒株19-ZQLJQ與2008年分離的美洲型NADC30毒株的ORF5基因序列同源性高達95.4%，親緣關系最近，同屬于亞群3，說明與廣西毗鄰的廣東省已出現美洲型毒株NADC30的感染。廣東毒株出現在亞群3中，預示著廣東地區已出現了新的PRRSV毒株，應當給予高度關注，如果各豬場不做好充足的準備，采取有效的防控策略阻止NADC30毒株的感染，后果將不堪設想。

對于PRRS的防控，中國農業大學楊漢春教授認為，豬場應樹立綜合防控PRRS的理念，走出過分依賴疫苗的誤區，將生物安全控制措施放在首位，積極探索閉群飼養、毒株馴化、多點飼養等方式，建立適合自身豬場的綜合防控體系。養豬業發達的國家（如美國）也并非完全依賴于疫苗，而是積極探索行之有效的控制策略。美國的實踐經驗表明，通過采取嚴格的生物安全措施，切斷PRRSV 的傳播途徑和消滅傳染源是預防豬群感染PRRSV 的最有效措施。據悉，我國生豬產業技術體系的京安綜合試驗站堅持采用閉群技術控制PRRS，同時采取生物安全控制措施、后備母豬馴化、PRRSV檢測和淘汰陽性種豬，經過3年的工作，種豬群達到了PRRSV陰性，豬群生產性能穩定。

關于高致病性PRRSV NADC30毒株的防控，楊漢春教授表示，目前市售疫苗對此毒株究竟有無保護率，尚無明確數據；而獸醫病理學博士遇秀玲女士則認為，NADC30毒株和美國的VR2386株具有同源性，JXA1-R株活疫苗對于VR2386毒株具有很好的防控效果，因而我們養豬人士同樣可以用JXA1-R株活疫苗來防控高致病性NADC30毒株帶來的豬藍耳病感染。

經本實驗室調查發現，通過實驗室確診為PRRSV陽性的豬場，大部分均免疫過PRRS高致病性弱毒疫苗，但卻不能阻止PRRS的發生。有的豬場常年發生呼吸系統疾病，在沒有經過實驗室確診病原的情況，直接選取一種PRRS疫苗進行免疫；有的豬場在發生呼吸系統疾病后，免疫PRRS疫苗，免疫幾個月后覺得沒有明顯的效果，馬上停止免疫，這些豬場在使用疫苗方面均存在一定的盲目性和隨意性，對PRRS的防控極為不利，而且還可能引發新的毒株在豬場流行。

豬場任何疾病的發生均與飼養管理水平、環境消毒衛生、飼養密度、免疫預防措施以及發病隔離機制等息息相關，單純依靠疫苗來控制PRRS難以奏效，必須采取綜合防控的措施。如果豬場沒有免疫過PRRS疫苗，可將生物安全控制措施放在首位，積極探索閉群飼養、毒株馴化、多點飼養等方式，建立適合自身豬場的綜合防控體系。如果豬場一直在免疫PRRS疫苗，可堅持使用，但不能高頻次免疫，以免造成疫苗毒株的擴散。使用疫苗前必須先檢測本豬場PRRSV毒株的類型，做ORF5基因的序列分析，確定與哪種疫苗毒株的同源性和親緣關系最接近，才能使用該種疫苗毒株進行免疫。當豬場發生明顯的發燒和呼吸系統疾病，懷疑是PRRS時，首先必須采取綜合防控措施，控制疾病的傳播，同時采樣進行實驗室檢測，并做ORF5基因的序列分析，確定感染的PRRSV毒株的類型，才能確定最終的防控方案。如果豬場感染了NADV30毒株，首先應采取綜合防控措施，并適當進行清群，如果豬場一直免疫的是JXA1-R株活疫苗，可繼續使用。總之，不管是何種毒株引起的PRRS，其防控原則均為：綜合防控措施為主，疫苗為輔，且疫苗需謹慎使用。

2016-06-01）