陸地棉m iR397b的生化功能驗證

丁 妍，王燕美，劉進元

（清華大學生命科學學院植物生物學研究中心植物分子生物學實驗室，北京 100084）

陸地棉m iR397b的生化功能驗證

丁 妍，王燕美，劉進元*

（清華大學生命科學學院植物生物學研究中心植物分子生物學實驗室，北京 100084）

植物中的漆酶（LAC）作為藍銅氧化酶家族的一個分支，可以聚合木質素單體形成木質素。擬南芥、番茄中miR397b可以調控LAC蛋白家族的表達，但驗證棉花中miR397b生化功能的相關報道目前尚無。選取開花后25 d的陸地棉纖維材料，通過RLM-5’RACE試驗，驗證了對GhLAC4 mRNA的切割發生在miR397b和GhLAC4的互補區域，即證明了GhLAC4是miR397b的靶基因。本研究預示著GhmiR397b可能參與棉花纖維中木質素的形成過程，為研究GhLAC4在棉花纖維發育過程中的調控作用提供了基礎。

陸地棉；纖維發育；miR397b；GhLAC4；靶基因；生化功能；降解

漆酶（laccase enzymes，LAC）是一種能夠結合多個銅離子的酚氧化酶［1］，可以把苯二酚氧化成苯醌，同時生成水；在生物體內，一些漆酶可以聚合木質素單體形成木質素［2］。漆酶最先在漆樹中被發現［3］，因為單體被它催化聚合形成的木質素屬于維管系統［4-5］，所以在高等植物中廣泛表達［6］。此外，在昆蟲、微生物等多種生物中也發現了漆酶［2，5，7］。在擬南芥中有17種漆酶家族蛋白［7］，其中LAC4、LAC11、LAC15、LAC17共4種漆酶蛋白參與木質素的合成［8-10］。雖然植物中漆酶參與木質素生物合成有據可查，但是與漆酶調控有關的生理功能有待探究。

MicroRNA是一類由21—24個核苷酸組成的內源性單鏈小分子RNA［11］，可以在轉錄水平上調控目的基因表達［12］，是植物對其生長發育及生理代謝調控的一種重要方式［13-15］。在現在已知的miRNA中，擬南芥中miR397、miR408、miR857，水稻中miR528已被證實可以調控漆酶的表達［16-17］，說明植物中木質素在基因表達的轉錄后水平上受miRNA調控。

MicroRNA中的miR397家族是漆酶的重要轉錄后調控因子，但是具體靶向作用未得到證實。楊樹中miR397a是LAC的負調控因子，預示著在木質形成過程中miRNA對木質素的形成有調控作用［10］。水稻中miR397通過負調控LAC基因的表達，影響對植株油菜素甾醇的敏感性，從而影響種子顆粒大?。?8］，這說明由miRNA調控的漆酶表達可能在木質素合成以外的其他生物過程中起作用［19］，增加了研究miRNA對LAC家族基因表達調控的重要性。通過生物信息學方法預測［17，20］，擬南芥中miR397可能直接切割LAC2、LAC4、LAC17 mRNA［1，7，21］，但是并未得到證實。

棉花屬于經濟作物，不僅是天然纖維的最重要來源，也是一種重要的模式生物，在植物研究尤其是單子葉植物研究中占有重要的地位［22］。棉纖維的發育過程中已有深入研究［23-25］，雖然木質化程度高，但是其中關于miRNA切割LACmRNA的研究甚少。為了研究棉花纖維中LAC是否是miR397b的靶基因，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum）開花后第25天纖維為材料，利用RLM-5’RACE試驗方法，在體外檢測GhmiR397b能否切割降解GhLAC4 mRNA。結果表明：GhLAC4 mRNA在與miR397b的配對區域的5’端第10個核苷酸處被降解，說明GhLAC4是GhmiR397b的靶基因，揭示了GhmiR397b對GhLAC4基因的切割作用。本研究的結果可為研究miRNA調控棉花纖維細胞生長發育提供有力線索。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種為陸地棉‘中棉35’（Gossypium hirsutum.cv CRI35），由中國農業科學院棉花研究所提供；克隆載體pEasy Blunt Simple、感受態細菌Trans1-T1、Ex Taq、DNase、T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶以及Real-time試劑盒購自TaKaRa公司；反轉錄試劑盒RNA PCR Kit（AMV）購于上海生物工程公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、DNA marker購自北京Tiangen公司；RLM-5’RACE試劑盒First Choice?RLM-RACE Kit購自Ambion公司，其他試劑均為國產分析純以上。引物合成以及克隆載體測序在上海生工生物技術公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花纖維細胞總RNA提取

摘取棉花開花后25 d棉桃，迅速置于液氮中冷凍，在液氮中充分研磨纖維，提取總RNA。確保總RNA不降解是本試驗可靠性和成功率的關鍵所在，由于空氣中含有RNA降解酶，提取總RNA、富集mRNA和反轉錄形成cDNA的試驗中幾乎所有器具都要保證RNase-free。

1.2.2 mRNA的富集

mRNA富集的原理是Oligo（dT）纖維素（以下簡稱纖維素）含有的多聚dT可以與mRNA 3’末端的polyA尾結合，從而吸附并富集mRNA。

1.2.3 植物RNA反轉錄合成cDNA

用反轉錄試劑盒RNA PCR Kit（AMV）反轉錄富集后的mRNA，按照說明書配制反應體系，反應條件：50℃30 h；95℃5 min。

1.2.4 RLM-5’RACE試驗

用Tdt酶向cDNA 5’端連接dATP，條件為37℃30 min。然后用PCR法把5’RACE接頭（5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATGATTTTTTTTTTTTT-3’）與poly dATP連接，該連接反應的條件：95℃5 min，40℃30 s，72℃10 min，1個循環。接著以cDNA第一條鏈作模板，以5’端外側引物和3’端外側引物（表1）進行第一輪巢式PCR擴增。以第一輪巢式PCR產物為模板，以5’端內側引物和3’端內側引物（表1）進行第二輪巢式PCR擴增。

表1 RLM-5’RACE試驗引物序列Table 1 Prim er sequence for RLM-5’RACE

1.2.5 電泳檢測及PCR產物回收

為了更好區分目的片段，用2%瓊脂糖凝膠和DL2000 DNAmarker檢測PCR結果，如果DNA條帶大小符合預期，則可以進行PCR擴增。使用2%濃度的瓊脂糖凝膠和DL2000 DNAmarker對PCR擴增產物進行電泳，用120 V電壓40 min，用成像系統保存圖像，切取目標條帶進行回收PCR產物回收。

1.2.6 連接克隆載體

把回收得到的靶標基因DNA連接到克隆載體pEASY-Blunt Simple上。按照說明書構建連接體系，連接條件為25℃，反應時間30 min。

1.2.7 轉化重組質粒

將連接產物加入30μL Trans-T1感受態中，冰上靜置30 min。42℃熱激90 s，立即放于冰上3 min。然后加1 mL LB液體培養基，37℃搖動培養1 h。把8μL 500 mM IPTG溶液與40μL 20 mg/mL X-gal溶液混合后，均勻地涂在含氨芐青霉素和卡納青霉素抗性的平板上培養基上。待IPTG、X-gal被吸收后，1 mL LB液體培養基（含轉化菌）4 000 r/min離心1 min，棄置部分上清液。保留200μL上清用來懸浮菌體，取150μL全部菌液涂板，37℃培養過夜。

1.2.8 陽性菌落篩選

挑取單菌落，各自加入1 mL含氨芐青霉素和卡納青霉素抗性的液體LB培養基，振蕩培養1 h。用菌落PCR法篩選陽性菌，即在普通PCR體系的基礎上，DNA來源為少量菌液。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR產物，如果條帶大小符合預期，則可以過夜培養，提取質粒。

1.2.9 提取質粒并測序

用堿裂解法提取菌液的質粒，進行測序。如果測序結果表明GhLAC4 mRNA被切割的位點在與GhmiR397b互補序列的3’端第10個核苷酸附近，則說明GhLAC4是GhmiR397b的靶基因。

1.2.10 小RNA文庫的構建和Illumina測序

以陸地棉開花后第5天、第10天、第15天、第20天、第25天纖維的RNA為材料，各自用10μg來構建小RNA文庫。操作流程為：（1）用15%的變性PAGE分離純化18—30個核苷酸的小RNA；（2）連接5’RNA接頭（5’GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC）；（3）連接3’RNA接頭（5’UCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGU）；（4）根據3’RNA接頭序列設計引物（5’CAAGCAGAAGACGGC-ATACGA）反轉錄小RNA，合成cDNA鏈；（5）再根據5’和3’RNA接頭序列設計引物（5’AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，5’CAAGCAGAAGACGGCATACGA），以上述步驟的cDNA鏈為模板進行PCR擴增，然后純化PCR產物，構建測序庫；（6）通過接頭序列將測序庫中的片段連接到光學透明的玻璃表面上，橋式PCR擴增形成數以億計的簇，每個簇都具有數千份相同模板；（7）利用Illumina Hiseq 2000測序儀，通過四種熒光標記染，通過可終止性的邊合成邊測序技術進行測序（測序引物5’CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC），通過CCD采集熒光信號，合成一個堿基的同時即將生成光信號轉換為核酸信息。

1.2.11 測序結果的初步處理及miR397b豐度檢測

通過高通量測序得到的小RNA序列在獲得高質量讀數之前，需要先去掉低質量讀數。所謂高質量讀數，一般認為1—30個堿基中不含N（無法辨別堿基種類時，用N表示）、質量值低于10的位點不超過4個且質量值低于13的位點不超過6個的片段為高質量序列。獲得高質量序列之后，去掉小于18個核苷酸的小片段、接頭序列、polyA序列，剩余的序列就是清潔讀數（Lean reads）。

把清潔讀數和miRBase中所有的miRNA序列進行比對，如果miRNA序列庫中的序列與已知的GhmiRNA397b的序列的錯配數小于等于2個，則認為該序列即為GhmiRNA397b。

2 結果與分析

2.1 GhLAC4 mRNA 5’端殘余片段的電泳檢測

如前所述，植物中miR397b可以調控LAC4的表達，且陸地棉中GhLAC4 mRNA與GhmiR397b存在互補序列，由此預測GhmiR397b可能通過與GhLAC4 mRNA的互補序列相互識別，GhmiR397b對GhLAC4 mRNA進行切割。

在植物中，miRNA對靶基因mRNA的進行切割的位點具有一定的規律。這個切割位點通常位于mRNA與miRNA的互補區域，具體在miRNA 5’端第10個和第11個核苷酸之間。通過RLM-5’RACE試驗，把GhLAC4 mRNA被降解后的殘余片段在體外逆轉錄成cDNA，經過巢式PCR擴增得到電泳條帶。瓊脂糖電泳結果（圖1）顯示，通過設計引物擴增獲得的片段大小約為430 bp，說明GhLAC4 mRNA被切割的位點在GhmiR397b與GhLAC4 mRNA互補區域附近，符合本研究的預期。這符合miRNA降解規律，說明GhLAC4是miRNA的靶基因。

2.2 GhLAC4 m RNA 5’端殘余片段擴增后的測序結果

把上述帶有約為430 bp擴增條帶的質粒進行測序，測序結果（圖2）顯示，GhLAC4 mRNA的切割位點在與GhmiR397b互補序列的3’端第10個核苷酸處。箭頭表示發生降解的位點，數值表示該處發生降解的克隆數與測序的克隆總數的比值。實線表示TC279559（GhLAC4）mRNA與GhmiR397b序列堿基互補配對完全正確，虛線表示堿基互補配對有誤。

在RLM-5’RACE試驗中，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小符合預期，且測序結果表明擴增的GhLAC4殘余片段的被降解位點在與miR397b互補序列的5’端第10個核苷酸處，符合miRNA降解規律，為GhLAC4是GhmiR397b的靶基因提供了有力證據。

圖1 GhLAC4 mRNA 5’端殘余片段的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of GhLAC4 mRNA 5’cleavage fragm ents

圖2 Ghm iR397b對TC279559（GhLAC4）mRNA靶向降解作用示意圖Fig.2 The cleavage site of TC279559（GhLAC4）mRNA targeted by GhmiR397b

2.3 棉花纖維發育過程中Ghm iR397b的豐度變化

miRNA歸一化讀?。≧eads per ten million，RPTM）是每一千萬個清潔讀數中目標miRNA的個數，被用來評估每個miRNA的相對豐度。實際計算和比較中，由于miRNA的歸一化讀數數字較大，常用log2RPTM表示miRNA的豐度。

由圖3可見，棉花纖維發育過程中，隨著開花后天數增加，GhmiR397b的豐度存在變化。開花后第5天、第10天棉花纖維細胞中GhmiR397b豐度較高，第15天、第20天、第25天時GhmiR397b豐度較高逐漸下降。

在棉花纖維發育過程中，開花后第0—5天胚珠表皮細胞發育成纖維，即第5天時所需LAC4表達量較少，這與GhmiR397b較高的豐度相符合；第5—25天纖維細胞快速伸長，木質素越到后期越需大量合成［26］，即需要LAC4表達量越來越多，這與GhmiR397b較豐度逐漸減少相符合。

近年來研究發現，水稻中miR397可以通過負調控LAC基因表達，影響對植株油菜素甾醇的敏感性，過表達OsmiR397能夠增加種子大小、促進圓錐花序分枝和增加主穗粒數，從而使得田間試驗中谷粒總產量增加25%［18］，這些研究增加了miR397調控LAC基因表達的重要性。另外，生物信息學的方法預測出擬南芥中miR397可能切割LAC2、LAC17 mRNA，miR397調控LAC基因表達的研究仍然需要進一步深入。

在RLM-5’RACE試驗中，靶基因mRNA被降解后的殘余片段很少，很多情況下即使有殘余片段也很難檢測出來，造成假陰性結果，這也是RLM-5’RACE試驗雖然能直接證明靶向降解作用，但是并未被廣泛使用的重要原因。本試驗對RLM-5’RACE試驗做出了重要改進，即在提取總RNA之后，通過富集mRNA增加mRNA的純度，從而增加靶基因mRNA被降解后的殘余片段被正確擴增的可能性。RLM-5’RACE試驗技術如果被進一步改進，實現miRNA在靶基因上的降解位點的批量、快速、準確檢測，會是miRNA的功能研究的一個強有力的助力。

圖3 陸地棉纖維細胞發育過程中m iR397b的豐度變化Fig.3 Content variation ofm iR397b at different fiber developm ental stages

3 結論

本研究以陸地棉‘中棉35’纖維為材料，提取中RNA后在體外把GhLAC4被割的殘余片段逆轉錄成cDNA，并用RLM-5’RACE方法進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小符合預期，且測序結果表明GhLAC4 mRNA的切割位點在與GhmiR397b互補序列的5’端第10個核苷酸處，且GhmiR397b的豐度變化與木質素含量變化有一定負相關關系，這些分析結果都為GhLAC4是GhmiR397b的靶基因提供了有力證據，預示著miR397b在棉花纖維中木質素的形成過程中起調控作用。本研究的結果可為miRNA調控棉花纖維細胞生長發育的分子機制研究提供了有力線索。

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（責任編輯：張睿）

Identification of the biochemical function of miR397b in Gossypium hirsutum

DING Yan1*，WANG Yan-mei1，LIU Jin-yuan1
（Lɑborɑtory of Plɑnt Moleculɑr Biology，Center for Plɑnt Biology，School of Life Sciences，TsinghuɑUniversity，Beijing 100084，Chinɑ）

It is reported that plant laccase enzymes（LAC），amember of the blue copper oxidase family，can polymerize lignin monomers into lignin.miR397b plays a role in the expression of LAC protein family in Arɑbidopsis and Lycopersicon.However，there is no report about biochemical identification ofmiR397b function.In this study，RLM-5’RACE experiment was carried out on the cotton fiber sampled at 25 days post-anthesis in vitro，and itwas validated that cleavage of GhLAC4 transcripts wasmediated by miR397b via a complementary region between them，and GhLAC4 was the targeted gene of GhmiR397b.These results suggested thatGhmiR397b might be involved in the lignin formation in cotton fiber，and provided an evidence for studies on the regulation role of GhmiR397b during cotton fiber development.

Gossypium hirsutum；Fiberdevelopment；miR397b；GhLAC4；Target gene；Biochemical function；Cleavage

S562

A

1000-3924（2017）01-010-05

2016-05-14

國家重點基礎研究發展計劃（2010CB126003）；國家轉基因動植物研究項目（2011ZX08005-003，2011ZX08009-003）作者簡介：丁妍（1989—），女，碩士，研究方向：植物分子生物學。E-mail：dingyan101＠163.com

*通信作者，E-mail：liujy＠mail.tsinghua.edu.cn