德國進境海棠樹根際中厚皮擬毛刺線蟲的鑒定

宋紹祎，劉靜遠，徐沈裕，戚龍君，于 翠，易建平

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

德國進境海棠樹根際中厚皮擬毛刺線蟲的鑒定

宋紹祎，劉靜遠，徐沈裕，戚龍君，于 翠，易建平*

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

從上海口岸進境的德國海棠景觀樹根際分離到1種擬毛刺屬線蟲。雌蟲雙生殖腺對伸，受精囊無，精子分布于子宮內；陰門孔狀，陰門骨化結構小，圓三角形到橢圓形，微分離。雄蟲腹中頸乳突1個，位于排泄孔前；精子大，胞核香腸形；交合刺末端微腹彎，桿區有橫紋；交合傘狹窄；泄殖腔前有3個腹中交配乳突。厚皮擬毛刺線蟲特異引物UNIVERSAL-F/PACHYREV2-R檢測為PCR陽性，其18S序列與GenBank中厚皮擬毛刺線蟲的序列相似性為99.30%—100%，序列差異為0—4 bp。基于18S序列構建的系統發育樹顯示該種線蟲與厚皮擬毛刺線蟲位于同一聚類組內。經形態分類鑒定、PCR檢測和序列分析，將此線蟲鑒定為厚皮擬毛刺線蟲Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus。這是我國口岸首次截獲該種線蟲。

厚皮擬毛刺線蟲；傳毒種；系統發育；鑒定

毛刺屬和擬毛刺屬線蟲是一類重要的植物根部遷移性外寄生線蟲，可影響根系生長，甚至引起根部生長停滯，導致植物產生短粗根病（stubby root disease）［1-4］。屬內的許多種線蟲還是一些植物病毒的傳播介體，可使許多經濟作物如果樹、蔬菜、農作物、花卉等造成嚴重的經濟損失，我國已將此類傳毒線蟲列入進境植物檢疫性有害生物名單。如：厚皮擬毛刺線蟲是煙草脆裂病毒（TRV）和豌豆早褐病毒（PEBV）的傳播介體，主要通過帶根苗木、土壤及介質土傳播，主要分布在歐洲的部分國家，如英國、愛爾蘭、比利時、德國、瑞士、法國、意大利、荷蘭等，我國僅在廣東有分布［5-7］。該類線蟲食性雜，不但直接取食為害寄主植物，而且具有傳毒能力，危害較大。

2015年5月，上海出入境檢驗檢疫局從德國進境海棠景觀樹根際截獲一種擬毛刺屬線蟲，并進行了形態特征觀察、PCR檢測和序列分析，現將鑒定過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

從進境大型海棠景觀樹根際深處多點采樣，土壤樣品約2 kg。室內采用淺盤法分離線蟲，將樣品置于淺盤中室溫浸泡過夜，500目網篩分離線蟲，在體視顯微鏡下鏡檢。

1.2 形態學特征觀察

挑取線蟲制成臨時玻片，在光學顯微鏡下進行形態特征觀察、測量及拍照，并采用de Man公式對線蟲進行測計。

1.3 DNA提取

挑取單條線蟲，滅菌水洗滌3次，用挑針捅破或割成多段，使用DNeasy Blood＆Tissue Kit（Qiagen）提取線蟲DNA，提取方法按照試劑盒使用說明書進行，獲得擬毛刺屬線蟲樣本7520的DNA。

1.4 PCR檢測

使用厚皮擬毛刺線蟲特異引物UNIVERSAL-F（5’-cccgtcgctactaccgatt-3’）/PACHYREV2-R（5’-gcgtacgggcaatacgatac-3’）采用PCR方法擴增線蟲DNA［8］。PCR反應體系包括：10×PCR Buffer（Mg2＋free）2.5μL，Mg2＋（25 mmol/L）2μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2μL，引物（5μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL，ddH2O 16.1μL，總體積25μL。擴增程序為：94℃3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，35個循環；72℃10 min。預期擴增產物片段大小為329 bp［8］。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，EB染色后用凝膠成像系統分析。

1.5 18S序列擴增和分析

使用通用引物1091-F（5’-aggaattgacggaagggcac-3’）/1671-R（5’-tcctctaagtaa atcccattgg-3’）擴增線蟲DNA的18SRNA部分序列［9-10］，反應體系和擴增程序同1.4，擴增產物送上海生工生物技術服務有限公司進行雙向測序，序列核實拼接后和GenBank中相關種序列進行比對分析。基于18S序列，利用MEGA 4.0軟件以鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 測計值

厚皮擬毛刺線蟲德國群體雄蟲、雌蟲的測計值見表1及表2。

表1 厚皮擬毛刺線蟲（雄蟲）德國群體與其他群體的測計值比較Table 1 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♂）and other P.pachydermus（♂）population

表1 厚皮擬毛刺線蟲（雄蟲）德國群體與其他群體的測計值比較Table 1 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♂）and other P.pachydermus（♂）population

注：長度測量單位為μm

表2 厚皮擬毛刺線蟲（雌蟲）德國群體與其他群體的測計值比較Table 2 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♀）and other P.pachydermus（♀）population

表2 厚皮擬毛刺線蟲（雌蟲）德國群體與其他群體的測計值比較Table 2 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♀）and other P.pachydermus（♀）population

注：長度測量單位為μm

2.2 形態描述

雄蟲（圖1）：熱殺死后角質層顯著膨脹。唇區圓，具稍凸起的乳突。瘤針背弓，前部有誘導環。腹中頸乳突1個，位于排泄孔之前；排泄孔位于咽（食道）球的前端。腸前伸背覆蓋咽球，咽球內有5個核。單精巢，前伸，精子橢圓形，精子細胞核臘腸形。交合刺細長，末端微腹彎，桿部圓柱形，桿區有橫紋，引帶與交合刺平行。交合傘狹窄，泄殖腔前有3個腹中交配乳突，SP1、SP2位于交合刺收縮區，SP3位于交合傘前區，相距遠。亞腹交配乳突2對，第1對位于肛門后，不明顯；第2對位于尾孔前，較大。尾長與肛門處體寬幾乎等長。

雌蟲（圖2）：熱殺死后角質層顯著膨脹。體前部類似于雄蟲。雙生殖腺、對伸，受精囊無，精子分布于子宮內。陰門位于蟲體中部稍后，陰門后觀察到3個側體孔。陰道近圓形，深度約為體寬的l／3。陰門孔狀（腹面觀），側面觀陰門骨化結構小，圓三角形到橢圓形，微分離。肛門近尾端，尾非常短，鈍圓形。

圖1 厚皮擬毛刺線蟲（雄蟲）形態特征Fig.1 M orphological characters of P.pachydermus（）

圖2 厚皮擬毛刺線蟲（雌蟲）形態特征Fig.2 M orphological characters of P.pachydermus（）

2.3 PCR檢測

線蟲樣本7520的DNA用厚皮擬毛刺線蟲特異引物UNIVERSAL-F/PACHYREV2-R進行PCR擴增，獲得329 bp的特異性DNA片段，空白對照沒有擴增產物（圖3）。試驗結果表明：線蟲樣本7520為厚皮擬毛刺線蟲PCR陽性。

2.4 18S序列分析和系統發育分析

引物1091-F/1671-R擴增線蟲樣本7520的DNA獲得18S部分序列，長度為570 bp，GenBank登錄號為KU052863，與GenBank中厚皮擬毛刺線蟲P.pɑchydermus相關序列（FJ040483，AJ439574，AJ439512，JN123367，DQ345525，AF036601）的相似性為99.30%—100%，序列差異為0—4 bp。

根據GenBank中厚皮擬毛刺線蟲及其近似種18S序列構建的系統發育樹顯示，線蟲樣本7520與P.pɑchydermus位于同一聚類組內（圖4）。

圖4 基于厚皮擬毛刺線蟲18S序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S sequences of P.pachydermus（Neighbour-Joining，NJ）

2.5 鑒定結果

根據Decraemer等［12-13］建立的毛刺科線蟲形態分類多歧檢索表，本研究中德國群體的鑒定代碼為：雌蟲D1-C1-L2-K2-A2（3）-B2-E2-F3-G1-H3-I1-J19-M1-N1-O2-P1-Q1-R2-S1，雄蟲F3-D1-P1-A2-B2-C2-E0-G2-H2-I3（1）-J2-K3-L2-M2/7-N1-O1，在多歧檢索表中對應的線蟲種類均為厚皮擬毛刺線蟲。進一步分析，該德國群體的形態特征與已報道的厚皮擬毛刺線蟲形態特征基本一致，因此將其鑒定為厚皮擬毛刺線蟲；結合PCR檢測和序列分析結果，確認德國進境海棠景觀樹根際截獲的擬毛刺屬線蟲為厚皮擬毛刺線蟲（Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus Siddiqi，1974）。

3 討論

18S序列分析結果表明：厚皮擬毛刺線蟲德國群體與P.mɑcrostylus進化關系很近，其與P.mɑcrostylus（AJ439621，AJ439507，AJ439622）的序列相似性為99.82%，序列差異為1 bp（569/570）；與西班牙擬毛刺線蟲P.hispɑnus（AJ439577）的序列相似性為98.95%，序列差異為6 bp（564/570）；與胼胝擬毛刺線蟲P. porosus（DQ345524）的序列相似性為96.49%，序列差異為20 bp（550/570）。

毛刺科線蟲是世界性分布的一類植物寄生線蟲，在歐洲和北美的分布最為廣泛［2，6］，其傳播病毒造成的損失遠遠大于線蟲本身取食造成的危害，因此其作為傳毒線蟲引起了多國的重點關注。自1960年報道厚皮擬毛刺線蟲可以傳播煙草脆裂病毒以來，已證實毛刺屬5種及擬毛刺屬10種線蟲為傳毒種類［2］。

近年來，隨著國際間貿易往來的日益頻繁，進出境種苗及其植物繁殖材料越來越多，各種植物病害尤其是線蟲病害傳播的機會大大增加。如1989年發現于美國弗羅里達州櫟屬植物根圍的Trichodorus velɑtus是隨人事操作從歐洲傳入本土的，中美和南美報道的毛刺科線蟲是隨外來植物的引進而帶入本土的，其中較多種屬于擬毛刺屬［2］。一旦檢疫性傳毒線蟲隨進境種苗傳入我國，將給我國農林生產部門帶來嚴重威脅。

目前，擬毛刺屬的形態學鑒定主要依據Decraemer等［12-13］的多歧檢索表初步確認到種，再結合具體形態學特征進一步確定，要求鑒定人員具有良好的分類學基礎。隨著分子生物學技術的發展，PCR技術在植物線蟲學領域中的應用愈來愈多，線蟲學家已開始嘗試采用分子方法來研究該類線蟲。本研究詳細描述了厚皮擬毛刺線蟲形態特征和分子檢測技術，旨在為該種類線蟲的檢疫鑒定提供參考依據。

［1］趙立榮，何日榮，武目濤，等.從日本進境的景觀植物根際截獲的兩種毛刺線蟲［J］.植物檢疫，2014，28（2）：15-24.

［2］李戌清.毛刺線蟲科（Trichodoridae）一些種群形態及分子系統學研究［D］.杭州：浙江大學，2010.

［3］王壽華，繆作清，張景鳳.蘋果短粗根病的發生及病原線蟲種的鑒定［J］.植物病理學報，1994，24（1）：62-66.

［4］林麗飛，李衛芬，胡先奇，等.繡球花短粗根病病原線蟲的種類鑒定［J］.植物保護，2009，35（2）：131-133.

［5］杜宇，蔣小龍，葛建軍，等.GB/T 24830—2009擬毛刺線蟲屬（傳毒種類）檢疫鑒定方法［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［6］杜宇，朱水芳，周劍，等.中國進境植物檢疫性傳毒線蟲評價［J］.植物檢疫，2008，22（5）：300-305.

［7］黎少梅，馮志新.廣東省為害菠蘿和菠蘿根際線蟲的種類調查和鑒定［J］.華南農業大學學報，1995，16（2）：44-51.

［8］BOUTSIKA K，PHILLIPSM S，MACFARLANE SA，et al.Molecular diagnostics of some trichodorid nematodes and associated Tobacco rattle virus［J］.Plant Pathology，2004，53（1）：110-116.

［9］DUARTE IM，DE ALMEIDA M TM，BROWN D JF，et al.Phylogenetic relationships，based on SSU rDNA sequences，among the didelphic genera of the family Trichodoridae from Portugal［J］.Nematology，2010，12（2）：171-180.

［10］KUMARIS，SUBBOTIN SA.Molecular characterization and diagnostics of stubby root and virus vector nematodes of the family Trichodoridae（Nematoda：Triplonchida）using ribosomal RNA genes［J］.Plant Pathology，2012，61（6）：1021-1031.

［11］HUNTD J.Aphelenchida，Longidoridae and Trichodoridae-Their Systematics and Bionomics［M］.United Kingdom（Albans）：Wallingford（UK）CAB International，1993：277-279.

［12］DECRAEMERW，BAUJARD P.A polytomous key for the identification of species of the family Trichodoridae Thorne，1935（Nematoda：Triplonchida）［J］.Fundamental and applied Nematology，1998，21（1）：37-62.

［13］DECRAEMERW，BAUJARD P.Additions and corrections to：Decraemer：The Family Trichodoridae［J］.Fundamental and applied Nematology，1998，21（2）：207-212.

（責任編輯：閆其濤）

Identification of Paratrichodorus pachydermus in the rhizosphere of cherry-app le tree im ported from Germany

SONG Shao-yi，LIU Jing-yuan，XU Shen-yu，QILong-jun，YU Cui，YIJian-ping*
（Shɑnghɑi Entry-Exit Inspectionɑnd Quɑrɑntine Bureɑu，Shɑnghɑi200135，Chinɑ）

One species of Pɑrɑtrichodorus nematode was isolated from rhizosphere of cherry-apple tree imported from Germany at Shanghai Port.Female nematode was didelphic，lack of spermatheca.Its sperm was dispersed throughout the uterus and pore-like vulva rounded triangular or oval，with small vaginal sclerotized pieces.Male nematode had one ventromedian cervical papillae in front of excretory pore，large sperm cells with large sausage-shaped nucleus，distal end of spicule nearly straight，spicules shaft with striation，arrow bursa and three ventromedian precloacal supplements.PCR amplification was positive with specific primers for P. pɑchydermus.Sequence analysis revealed that its 18S-sequence had 99.30%—100%identity with P. pɑchydermus in GenBank.Phylogenetic tree of the 18S sequences showed this species clustered with P. pɑchydermus.Based on the morphological characteristics，PCR detection and sequence analysis，this kind of nematode was identified as P.pɑchydermus.This is the first report of interception of P.pɑchydermus in China.

Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus；Virus-vector；Phylogeny；Identification

S41；S685

A

1000-3924（2017）01-079-05

2015-09-29

上海出入境檢驗檢疫局科技項目（HK004-2014）；上海市綠化和市容管理局攻關項目（G152427）

宋紹祎（1971—），女，本科，高級農藝師，主要從事檢疫性線蟲的檢測鑒定。E-mail：songsy＠shciq.gov.cn

*通信作者，Tel：021-38620575，E-mail：yijp＠shciq.gov.cn