豬M II期卵母細胞玻璃化冷凍后的凋亡途徑研究

吳彩鳳，戴建軍，鈕瑩芳，張樹山，陳亞寧，張德福

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

豬M II期卵母細胞玻璃化冷凍后的凋亡途徑研究

吳彩鳳，戴建軍*，鈕瑩芳，張樹山，陳亞寧，張德福*

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

為闡明豬卵母細胞玻璃化冷凍后的細胞凋亡模式，本試驗利用原位熒光染色技術對凍后卵母細胞死亡受體介導的外源性凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑中的Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和總Caspase活性進行檢測，用RT-PCR技術對不同途徑中關鍵基因進行mRNA表達檢測。結果顯示：豬MII期卵母細胞冷凍后，死亡受體外源性凋亡途徑的Caspase 8熒光強度值（32.03）和線粒體內源性凋亡途徑的Caspase 9熒光強度值（16.56），以及兩者共同途徑中的Caspase 3和總Caspase熒光強度值（16.70和8.43）均顯著高于新鮮卵母細胞對照組所對應的熒光強度值（分別為4.02、4.83、4.23和3.08）。死亡受體外源性凋亡途徑TNFα、FɑsL、CASP8和CASP3基因表達量也均有一定水平的提高，線粒體介導的內源性凋亡途徑中CASP9、CASP3和P53基因表達水平呈上升趨勢，而Bcl2、BAX、SOD1和survivin的基因表達水平顯著下降。綜上所述，死亡受體介導的外源性凋亡和線粒體介導的內源性凋亡共同參與了豬MII期卵母細胞凍后的凋亡過程。

豬；卵母細胞；玻璃化；細胞凋亡

卵母細胞冷凍保存可使其利用不受時間和空間的限制，最大限度提高卵母細胞的綜合利用效率。然而由于豬卵母細胞脂肪含量高，對低溫敏感等因素，導致其產生冷凍損傷［1-2］。在冷凍保存中，卵母細胞和胚胎的退化也初步被認為是由細胞凋亡過速引起的［3-5］。然而，目前關于豬卵母細胞的損傷機理的研究還很少。細胞凋亡是細胞在一定條件下接受刺激信號并受基因調控的一種自主性、程序性死亡過程［6］。死亡受體外源性凋亡途徑和線粒體內源性凋亡途徑是哺乳動物細胞凋亡的兩個主要途徑，也是卵母細胞和胚胎早期發育過程中細胞凋亡的主要途徑［7］。然而關于冷凍影響卵母細胞和胚胎凋亡途徑的研究還很少。

本研究對豬MII期卵母細胞進行冷凍解凍，并利用原位熒光染色的方法，對解凍后卵母細胞中線粒體內源性凋亡途徑和死亡受體外源性凋亡途徑中的Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和總Caspase水平進行檢測，利用熒光定量PCR技術，檢測線粒體內源性凋亡途徑和死亡受體外源性凋亡途徑中的關鍵基因mRNA表達水平，從而初步判斷凍后豬卵母細胞的可能凋亡途徑，為日后進一步提高豬卵母細胞冷凍效率提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別說明外，所有化學試劑均購自Sigma公司，培養液和血清購自Gibco公司。玻璃化冷凍所用的OPS（Open Pulled Straw）管由本實驗室自制，其由常規0.25 mL麥管拉長拉細而獲得。

1.2 方法

1.2.1 豬卵母細胞體外成熟

豬卵巢采集于上海五豐上食有限公司屠宰場，置于38.5℃的生理鹽水中1 h內運回實驗室。使用18號針頭注射器采集卵巢表面2—6 mm卵泡中卵丘-卵母細胞復合體。選擇至少包裹3層顆粒細胞，且胞質均勻的卵母細胞用于成熟培養，每65枚卵丘卵母細胞復合體于500μL成熟培養液中成熟培養，培養條件：38.5℃44 h，飽和適度。成熟培養后用0.1%的透明質酸酶消化以去除卵丘細胞，選擇胞質均勻，且排除第一極體的成熟卵母細胞用于后續試驗。

1.2.2 卵母細胞玻璃化冷凍和解凍

玻璃化冷凍時，卵母細胞先在冷凍平衡液（TCM199＋7.5%DMSO＋7.5%EG＋20%FBS）中處理5 min，再以微量體積移入玻璃化冷凍液（TCM199＋15%DMSO＋15%EG＋20%FBS＋0.5 mol/L蔗糖）中，15 s后開始用OPS管裝載卵母細胞，30 s內投入液氮中冷凍保存。

解凍時，從液氮中取出OPS管，迅速投入38.5℃預熱的0.5 mol/L蔗糖溶液中，使卵母細胞流出，5 min后移入0.25 mol/L的蔗糖溶液中，作用5 min，用TCM199洗滌3次，放入事先在CO2培養箱中平衡的卵母細胞恢復液（TCM199＋10%FBS）中恢復2 h，選擇形態正常的解凍卵母細胞用于后續試驗。

1.2.3 卵母細胞Caspase原位熒光檢測

Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9原位熒光染色試劑盒購于碧云天（BioVision，中國），參照說明書，使用前先將各自用FITC標記的抑制劑用清洗緩沖液進行1∶300稀釋，然后將卵母細胞移入染色液中，37℃孵育15 min后用清洗緩沖液洗滌2次，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。總Caspase原位熒光染色試劑盒購于BioVision（美國）公司，將FITC-VAD-FMK用TCM199稀釋至10μmol/L，卵母細胞染色15 min后用TCM199洗滌2次，然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。熒光照片是用Image-Pro Plus6.0軟件進行量化，記錄其熒光信號強度值，結果用熒光平均相對密度表示。

1.2.4 卵母細胞凋亡相關基因的RT-PCR檢測

每150枚豬MII期卵母細胞用于1次RNA提取。總RNA提取采用TIANGEN的RNApreo Pure微量樣品總RNA提取試劑盒進行，反轉錄使用TIANGEN的FastQuant RT kit反轉錄試劑盒.

RT-PCR操作時，從NCBI中獲得豬腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNFα）、Fas配體（Fas ligand，FɑsL）、CASP8、CAS9、CASP3、Bcl2、BAX、SOD1、P53和survivin基因的cDNA序列并設計引物，GAPDH作為內參基因。引物信息如表1所示。使用TAKARA的SYBR Premix Ex TaqTM II kit試劑盒進行RT-PCR檢測。反應體系為20μL，包括：cDNA模板2.0μL、SYBR Premix Ex Taq II 10μL、Forward Primer 0.8μL、Reverse Primer 0.8μL、ROX II0.4μL和加RNase-Free ddH2O補至20μL。反應條件：預變性95℃30 s，變性95℃5 s，退火34 s（Tm均為55℃），72℃延伸30 s，循環35次，退火處收集熒光。在ABI7500實時熒光定量PCR儀上運行，每個樣品重復3次。基因的相對表達量采用2－△△Ct法計算比較［7］。

表1 RT-PCR引物信息Table 1 Primer information for RT-PCR

1.2.5 生物統計

測定結果采用SPSS 17.0進行數據分析，以P＜0.05作為差異顯著評判標準，以*表示。RT-PCR以GAPDH為內參基因。

2 結果與分析

2.1 OPS冷凍對豬M II期卵母細胞多種Caspase水平的影響

本試驗分別利用Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和總Caspase原位免疫熒光染色試劑，分別對死亡受體外源性凋亡途徑中的Caspase 8、線粒體內源性凋亡途徑中的Caspase 9，以及兩者共同作用途徑中的Caspase 3與總Caspase進行原位熒光染色。結果如圖1所示：無論是Caspase 8、Caspase 9，還是兩者共同作用中的Caspase 3和總Caspase，冷凍后卵母細胞的原位熒光強度均顯著高于未冷凍的新鮮組。

圖1 新鮮和冷凍卵母細胞不同Caspase的原位熒光染色Fig.1 Cspases’in situ fluorescence stainings of fresh and vitrified porcine oocytes

所獲得的卵母細胞熒光圖片采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化，結果如表2所示。OPS冷凍保存后，死亡受體外源性凋亡途徑中的Caspase 8的熒光強度值（32.03），線粒體內源性凋亡途徑中的Caspase 9的熒光強度值（16.56），兩者共同途徑中的Caspase 3和總Caspase的熒光強度值（16.70和8.43）均顯著高于對照組新鮮卵母細胞所對應的熒光強度值（4.02，4.83，4.23和3.08，P＜0.05）。提示死亡受體介導的外源性凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑可能均參與了凍后卵母細胞的凋亡。

表2 OPS冷凍對豬卵母細胞不同Caspase原位熒光染色后熒光強度的影響Table 2 Effect of OPS vitrification on porcine oocytes’fluorescence intensity after different-caspase in situ fluorescence staining

2.2 OPS玻璃化冷凍后對卵母細胞凋亡相關基因表達的影響

本試驗利用相對熒光定量PCR檢測了凍后死亡受體外源性凋亡途徑中TNFα、FɑsL、CASP8和CASP3和線粒體介導的內源性凋亡途徑中CASP9、CASP3、Bcl2、BAX、SOD1、P53和survivin等基因的mRNA表達狀況（圖2）。卵母細胞OPS冷凍后，TNFα和FɑsL的相對表達量分別為新鮮卵母細胞組的2.12和3.78倍，差異極顯著（P＜0.05），CASP8的基因表達量也有所升高（P＜0.05）。冷凍后CASP9、CASP3和P53的基因表達水平提高，Bcl2、BAX、SOD1和survivin的基因表達水平下降（P＜0.05），其中CASP9的表達水平提高5.39倍，而Bcl2和survivin的表達水平則僅為新鮮組的0.24和0.23倍。

圖2 冷凍對卵母細胞不同凋亡途徑中凋亡相關基因表達的影響Fig.2 Effect of vitrification on expression of genes related in different apoptotic pathways

3 討論

死亡受體外源性凋亡途徑和線粒體內源性凋亡途徑是哺乳動物細胞凋亡的兩個主要途徑。也被證實是卵母細胞和胚胎早期發育過程中細胞凋亡的主要途徑［8］。死亡受體外源性凋亡途徑則是由死亡受體與相應配體相結合而被激活，經過級聯反應，逐級激活起始胱天蛋白酶（如Caspase 8）和效應胱天蛋白酶（Caspase 3，7等），從而導致細胞發生凋亡［9］。死亡受體介導的細胞凋亡途徑中研究最為詳細和最具代表的是受體Fas介導的信號轉導途徑［10］。線粒體內源性凋亡途徑通過凋亡誘導因子引起線粒體細胞色素C釋放，作為凋亡誘導因子，細胞色素C能與凋亡酶激活因子1、Caspase 9前體、ATP/dATP形成凋亡體，召集并激活Caspase 3，引發Caspases級聯反應，導致細胞凋亡［11-12］。

本試驗中，卵母細胞在玻璃化冷凍后TNFɑ和FɑsL的相對表達量都顯著升高，提示冷凍導致卵母細胞感應外界凋亡信號敏感性增加。CASP8的基因表達和活性是啟動外源性凋亡途徑的重要因素［13-14］。本試驗中外源性凋亡途徑中的激發因子CASP8 mRNA豐度，Caspase 8活性均在冷凍后顯著提高，表明冷凍啟動了豬卵母細胞的外源性凋亡途徑，在細胞內形成凋亡誘導信號復合物DISC（Death-inducing signaling complex，DISC），啟動Caspase級聯反應。

Dai等［15-16］研究表明，冷凍可造成卵母細胞線粒體形態、功能和分布的顯著損傷，導致細胞內ROS水平的顯著升高。Somfai等［17］研究表明冷凍能引起卵母細胞內細胞色素C的釋放，使ROS水平顯著升高。Ren等［18］研究表明去脂后豬冷凍卵母細胞的線粒體功能提高，ROS水平降低證明冷凍導致卵母細胞氧化損傷。由于巰基乙醇可改變細胞內的ROS水平，Gupta等［19］在冷凍前進行添加巰基乙醇結果提高了卵母細胞的抗凍能力。線粒體跨膜電位的消失、氧化損傷與細胞凋亡等相關［6］，凋亡誘導因子（Apoptosisinducing factor，AIF）及細胞色素C在凋亡中發揮重要的作用，細胞接到凋亡信號后，線粒體釋放出來的細胞色素C在ATP或dATP的協同作用下與凋亡蛋白酶活化因子I結合，使其分子結構改變而激活Caspase9前體，并進一步激活其下游Caspase 3等酶系列，啟動Caspase級聯反應，最終促進細胞凋亡［20］。本研究結果表明，線粒體相關功能基因SOD1在冷凍后其mRNA表達量顯著下降，說明細胞的抗氧化能力顯著下降。Caspase 9是線粒體內源性凋亡途徑中Caspase級聯反應的激發者，本試驗中，CASP9在豬卵母細胞的mRNA表達量和活性均顯著升高，表明冷凍激發了其內源性凋亡途徑。

Bcl2和survivin是線粒體凋亡途徑中的重要調控因子，其能夠抑制細胞凋亡的發生，被認為是細胞凋亡狀態的重要標識分子［21-22］。本研究中卵母細胞冷凍后這兩個凋亡相關因子表達量均有所下降，一方面表明凍后卵母細胞確實發生了細胞凋亡，另一方面也顯示其可能參與了線粒體介導的內源性凋亡途徑。

Caspase 3是細胞凋亡執行的效應分子，參與凋亡過程中細胞皺縮、染色質固縮和凋亡體形成等多個過程［23］。現今Caspase 3和總Caspase的原位熒光染色已經被廣泛用于哺乳動物和胚胎凋亡狀況的檢測［23-25］。Ebrahimi在綿羊的GV期卵母細胞中發現，凍后其Caspase 3的活性顯著升高，與其染色體損傷呈正相關，與本試驗中CASP3基因表達量的升高和原位熒光染色后的活性增加的研究結果相一致。在總Caspase的凋亡檢測方面，Gualtieri等在人卵母細胞的慢速冷凍中發現，凍后卵子的總Caspase水平顯著升高［25］。在豬上，Vallorani等［4］利用Cryotop法對豬MII期卵母細胞進行玻璃化冷凍，結果凍后其FITCVAD-FMK染色后的總Caspase水平比冷凍前有顯著提高。本試驗中我們亦采用FITC-VAD-FMK對OPS冷凍的卵母細胞進行染色，結果獲得了與上述研究相類似的結論，表明冷凍后卵母細胞的Caspase的活性發生了活化，促進了細胞凋亡的發生。

本研究結果顯示，死亡受體介導的外源性凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑共同介導了玻璃化冷凍后豬MII期卵母細胞凋亡的發生。

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（責任編輯：程智強）

The apoptotic pathways of vitrified porcine oocytes at MII stage

WU Cai-feng，DAIJian-jun*，NIU Ying-fang，ZHANG Shu-shan，CHEN Ya-ning，ZAHNG De-fu*
（Division of Animɑl Genetic Engineering，Shɑnghɑi Key Lɑborɑtory of Agriculturɑl Geneticsɑnd Breeding；Animɑl Husbɑndryɑnd Veterinɑry Reseɑrch Institute，Shɑnghɑi Acɑdemy of Agriculturɑl Sciences，
Shɑnghɑi201106，Chinɑ）

In order to clarify the appopotic pathways of MII-stage porcine oocytes after vitrification，the Caspase 3，Caspase8，Caspase9 and Pan-caspase activities of vitrified porcine oocytes in death receptormediated and mitochondrion mediated apoptotic pathways were determined by in situ fluorescence staining，and themRNA expressions of key genes in different pathwayswere also detected by RT-PCR.The results were as follows：After vitrification of the MII-stage oocytes the fluorescence intensity values of Caspase 8，Caspase 9，Caspase 3 and Pan-caspase were respectively 32.03，16.56，16.70 and 8.43，and significantly higher than those of fresh oocytes’control groups（being 4.02，4.83，4.23 and 3.08 respectively）.After vitrification the expression levels of TNFα，FɑsL，CASP8 and CASP3 genes had a certain increasing，those of CASP9，CASP3 and P53 genes presented an upward trend，whereas those of Bcl2，BAX，SOD1 and survivin genes significantly decreased.It was concluded that the apoptosis of MII-stage porcine oocytes after freezing was implicated in both death receptor mediated and mitochondrion mediated apoptotic pathways.

Pig；Oocyte；Vitrification；Apoptosis

S828

A

1000-3924（2017）01-138-06

2016-01-05

國家自然科學基金（31372315）；國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08006-005）；上海市農業委員會青年人才計劃（2014-1-32，2014-1-33）

吳彩鳳（1983—），女，碩士，助理研究員，主要從事動物胚胎工程研究。E-mail：wucaifengwcf＠163.com

*通信作者，張德福E-mail：zhangdefuzdf＠163.com；戴建軍E-mail：blackman0520＠126.com