糖尿病小鼠心肌組織中線粒體轉錄因子A的表達

周益盛，荊 哲，劉峰舟，高玉婷*

(1蘭州軍區蘭州總醫院安寧分院心腎內科，蘭州 730070；2蘭州軍區蘭州總醫院心血管內科；3第四軍醫大學西京醫院心血管內科；*通訊作者，E-mail：937027447@qq.com)

糖尿病小鼠心肌組織中線粒體轉錄因子A的表達

周益盛1，荊 哲2，劉峰舟3，高玉婷2*

(1蘭州軍區蘭州總醫院安寧分院心腎內科，蘭州 730070；2蘭州軍區蘭州總醫院心血管內科；3第四軍醫大學西京醫院心血管內科；*通訊作者，E-mail：937027447@qq.com)

目的 觀察db/db糖尿病小鼠與正常小鼠心肌組織中線粒體轉錄因子A(TFAM)的表達水平。 方法 9只雄性db/db糖尿病小鼠，隨機分為6周組(db/db 6 week)，12周組(db/db 12 week)，18周組(db/db 18 week)；正常雄性小鼠9只，隨機分為6周組(wt 6 week)，12周組(wt 12 week)，18周組(wt 18 week)，每組3只。分別用實時定量PCR、Western blot法檢測心肌組織中TFAM的表達。利用實時定量PCR檢測心肌組織中線粒體拷貝數。 結果 db/db糖尿病小鼠TFAM的表達及線粒體拷貝數低于正常組，且隨年齡的增長表達逐漸降低，同時研究還發現，db/db小鼠心肌組織中心肌組織ATP的生成明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長，ATP的生成逐漸降低。 結論 糖尿病小鼠心肌組織中TFAM表達進行性降低。

2型糖尿病； 心??； 線粒體轉錄因子A； 線粒體； 小鼠

糖尿病是一種常見的由內分泌系統代謝障礙引起的慢性終身疾病[1]，表現為高血糖、高血脂等代謝紊亂[2]，長期糖尿病可導致心血管系統、神經系統及泌尿系統等多種系統的慢性損害[3]。近年來流行病學調查顯示，糖尿病患者中70%以上死于心血管相關性疾病，明顯高于非糖尿病患者心血管系統疾病。而其中糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者主要心臟并發癥之一[4]。糖尿病心肌病是指在糖尿病患者機體基礎代謝平衡紊亂的基礎上引發的心臟微血管病變和心肌代謝紊亂，最終導致心肌廣泛壞死[5]。糖尿病心肌病發病初期主要以心肌順應性下降和舒張功能不全為主要表現，若患者長期血糖控制不佳或治療不當，發展至晚期則以收縮功能不全為主要表現，嚴重時甚至可發展為充血性心力衰竭[6]。

線粒體在維持和發揮細胞生物學功能中發揮著重要作用，是細胞生命進程中的重要細胞器[7]。近期研究表明，細胞線粒體功能的紊亂與糖尿病心肌病的發病及進展密切相關[8]。而其中維持一定數量正常功能的線粒體，對細胞生物學功能的發揮至關重要[9]。線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)是在哺乳動物調控線粒體復制和轉錄過程的重要調控因子[10]，有研究顯示，線粒體DNA轉錄激活過程、基因組復制及調節線粒體mtDNA拷貝數，TFAM都在其中發揮重要的調控作用[11]。TFAM基因位于10號染色體長臂21區上，長度為10-25 kb，有6個內含子，所編碼的蛋白相對分子質量為25000，包含2個短串聯的高遷移率族蛋白盒域，其間以27個氨基酸連接，其后是1個相對富含酸性氨基酸C末端[12]。已有研究證實，在心血管相關疾病中TFAM發揮著一定的調控作用[13,14]。本研究通過db/db糖尿病心肌病模型，探討不同周齡糖尿病心肌組織中TFAM的表達變化，期望進一步闡述糖尿病心肌病中心肌線粒體DNA轉錄激活和基因組復制、線粒體mtDNA拷貝數的變化在糖尿病心肌病發生及發展中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 動物實驗與分組

正常組(wt)小鼠為c57小鼠，db/db糖尿病小鼠為近交系小鼠(C57BL/Ks)，c57及db/db糖尿病小鼠為清潔普通級動物，購買周齡均為3-4周，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司(動物許可證號：SCXK蘇2011-0003)。根據實驗設計，采用隨機數字表法，將9只正常雄性小鼠分為3組，每組3只，分別飼養至6周(wt-6w)，12周(wt-12w)，18周(wt-18w)。另將9只雄性db/db糖尿病小鼠隨機分為3組，每組3只，分別飼養至6周(db-6w)，12周(db-12w)，18周(db-18w)。飼養到對應周齡后處死，取小鼠心臟左心室組織。

1.2 Western blot檢測TFAM蛋白表達水平

采用聚丙烯凝膠電泳(10%分離膠，5%濃縮膠)，80 V進行上層膠電泳，120 V進行下層膠電泳2 h后，采用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上(100 V恒壓，1 h)。5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，TFAM抗體(購自英國abcam公司)稀釋比例為1 ∶1 000，β-actin抗體(購自武漢三贏公司)稀釋比例為1 ∶3 000，4 ℃封閉過夜，兔二抗IgG抗體室溫孵育2 h，化學發光試劑盒進行檢測。

1.3 實時定量PCR檢測TFAM mRNA表達水平

采用實時定量PCR方法對不同處理組中心肌組織TFAM的mRNA表達水平進行檢測。Trizol(購自美國Invitrogen公司)法提取心肌組織的總RNA后反轉錄為cDNA。采用實時定量PCR法檢測，嚴格按照PCR檢測試劑盒的說明書操作(購自TaKaRa公司)。擴增TFAM基因的引物序列上游為：5′-GAAACGCCTAAAGAAGAAAGCA-3′，下游為5′-AAGTCCATGGGCTACAGAAAAA-3′;擴增內參GAPDH基因的引物序列上游為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游為5′- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.4 實時定量PCR檢測心肌組織線粒體mtDNA表達水平

方法及材料同1.3。心肌組織線粒體mtDNA基因的引物序列上游為：5′- CTGATACTAGTGGCATTCTCCGAGTTGCTGCTAAA-3′，下游為5′- TACCGGAATTCTTGTGAGGGACGGTAAAAGG-3′；擴增內參GAPDH基因的引物序列上游為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5 心肌組織ATP生成的檢測

采用ATP熒光檢測法(購自美國Invitrogen公司)。試劑準備：配制1 ml 1×Reaction Buffer:50 μl 20× Reaction Buffer+950 μl去離子水。配制1 ml 10 mmol/L D-luciferin儲存液：將上述步驟1中的1 ml Reaction Buffer加入到一整管D-luciferin(Component A, blue cap)中；-20 ℃避光。配制100 mmol/L DTT儲存液：加1.62 ml水至25 mg的DTT管(Component C，black cap)-20 ℃保存，若拿出溶解，請放置4 ℃，勿再次凍融；稀釋ATP做標曲。工作液制備：8.9 ml 去離子水；0.5 ml 20×Reaction Buffer (Component E)；0.1 ml 0.1 mol/L DTT；0.5 ml 10 mmol/L D-luciferin；2.5 μl firefly luciferase 5 mg/ml stock solution(Component B, red cap)；90 μl工作液+10 μl(ATP、裂解后樣本)。

1.6 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件進行處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織TFAM mRNA表達進行性降低

分別飼養db/db及正常組小鼠至6，12，18周，將此3個飼養時間點的不同分組的小鼠處死后，采用實時定量PCR檢測小鼠心肌TFAM mRNA表達。結果顯示，db/db小鼠心肌組織中TFAM的mRNA水平明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長表達逐漸降低(見圖1)。

2.2 心肌組織TFAM蛋白表達進行性下降

為了進一步明確TFAM在糖尿病心肌組織中的表達情況，采用Western blot檢測TFAM在心肌組織中的蛋白表達水平。結果顯示，db/db小鼠心肌組織中TFAM的蛋白表達明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長表達逐漸降低，這與實時定量PCR的結果相一致(P<0.05,見圖2)。

圖1 正常組及db/db小鼠心肌組織TFAM的mRNA表達水平(n=3)Figure 1 The TFAM mRNA level in normal group and db/db mice group (n=3)

圖2 正常組及db/db小鼠心肌組織TFAM的蛋白表達水平比較 (n=3) Figure 2 The TFAM protein level by Western blot in normal group and db/db mice group (n=3)

2.3 心肌組織線粒體mtDNA拷貝數隨周齡增長表達降低

為了進一步明確TFAM是否參與影響了糖尿病心肌組織中線粒體的復制和轉錄過程，通過實時定量PCR檢測心肌組織中線粒體mtDNA的拷貝數。結果顯示，db/db小鼠心肌組織中心肌線粒體mtDNA拷貝數明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長表達逐漸降低(P<0.05,見圖3)。

2.4 心肌組織ATP生成隨周齡增長表達降低

TFAM與線粒體的生物學功能密切相關，為了初步研究TFAM是否影響了糖尿病心肌組織中線粒體的生物學功能，我們對心肌組織中ATP的生成進行了檢測。結果顯示，db/db小鼠心肌組織中心肌組織ATP的生成明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長ATP的生成逐漸降低(P<0.01,見圖4)。

圖3 正常組及db/db小鼠心肌組織線粒體mtDNA拷貝數 (n=3)Figure 3 The mtDNA copy number in normal group and db/db mice group (n=3)

圖4 正常組及db/db小鼠心肌組織ATP生成量比較 (n=3)Figure 4 The level of ATP in normal group and db/db mice group (n=3)

3 討論

城市及農村人口中糖尿病患者呈逐年上升的趨勢，糖尿病的重要并發癥之一糖尿病心肌病對人類的健康造成嚴重的危害。近期有學者認為，糖尿病心肌病的發生與線粒體功能的異常密切相關[15]。TFAM通過對線粒體復制和轉錄過程的調控，影響線粒體DNA轉錄激活過程和基因組復制、調節線粒體mtDNA拷貝數，進而影響線粒體的生物學功能[16]。Yue等[17]研究指出，心肌細胞缺血再灌注損傷為線粒體DNA損傷所致，其機制可能與心肌細胞中TFAM的表達降低密切相關。Hickson-Bick等[18]研究發現，在新生大鼠心肌細胞中，TFAM通過激活線粒體的生物多樣性，抑制新生大鼠心肌細胞的程序性死亡，對心肌細胞產生保護作用。但TFAM在糖尿病心肌病中的作用及其機制尚不十分清楚。

本研究以瘦素受體敲除的db/db糖尿病小鼠為糖尿病心肌病疾病模型，首先檢測了TFAM mRNA的表達水平，結果提示db/db糖尿病小鼠心肌組織中TFAM的mRNA水平明顯低于正常組，且與小鼠的周齡呈明顯的負相關。為了進一步明確上述實驗的可信性，采用Western blot法對TFAM的蛋白表達進行了檢測，實驗結果與實時定量PCR的結果相一致。TFAM通過對線粒體復制和轉錄過程的調控，調節和影響線粒體mtDNA拷貝數，實時定量PCR實驗結果顯示，db/db小鼠心肌組織中心肌線粒體mtDNA拷貝數明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長表達逐漸降低。普遍研究認為，TFAM在發揮線粒體生物學功能中起到至關重要的作用，而ATP作為提供細胞能量物質，其主要來源于線粒體，因此，我們初步對TFAM是否對糖尿病心肌病中心肌組織線粒體ATP的生成產生影響進行了實驗，結果發現，db/db小鼠心肌組織中心肌組織ATP的生成明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長ATP的生成逐漸降低。

綜上認為，在糖尿病心肌病的發生及發展過程中，TFAM的表達進行性降低，這種變化可能引起線粒體復制和轉錄過程調控受到影響，線粒體DNA轉錄激活和基因組復制發生異常，進而引起線粒體mtDNA拷貝數發生改變，最終影響線粒體的生物學功能的發揮，如ATP的生成改變等，而這些改變可能最終導致糖尿病心肌病的發生。但由于實驗條件的限制，本實驗僅僅是對糖尿病心肌中TFAM的表達、心肌線粒體mtDNA拷貝數及其ATP的生成的改變進行了初步研究，并未對其具體機制進行更深層次的研究，這也導致了本研究具有一定的局限性。因此，以本課題的結果為依托，課題組將在后續研究中，對TFAM在糖尿病心肌組織中的表達定位及在糖尿病心肌病中發揮作用的深層次分子機制進行進一步的研究與探討，以期為糖尿病心肌病的治療提供新的潛在的治療靶點。

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Expression of mitochondrial transcription factor A in myocardium of diabetic mice

ZHOU Yisheng1,JING Zhe2,LIU Fengzhou3,GAO Yuting2*

(1DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegionAnningBranchCourts,Lanzhou730070,China;2DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegion;3DepartmentofCardiology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：937027447@qq.com)

ObjectiveTo investigate the altered expression of mitochondrial transcription factor A in db/db diabetic mice.MethodsNine male db/db mice were randomly divided into 3 groups(db/db 6 week, db/db 12 week and db/db 18 week) according to the feeding time,and nine male normal mice were also randomly divided into 3 groups(wt 6 week,wt 12 week and wt 18 week). The expression of TFAM was detected by real-time PCR and Western blot. The mtDNA copy number was detected by real-time PCR.ResultsCompared to normal group, the expression of TFAM and the mtDNA copies were decreased significantly in db/db mice group, and decreased gradually as the prolonging of feeding. ATP level showed the same tendency.ConclusionThe expression of TFAM is gradually decreased in db/db diabetic mice.

type 2 diabetes mellitus; myocardium； TFAM； mitochondria; mice

周益盛,男,1984-01生，學士, 住院醫師，E-mail:zysgml@qq.com

2016-11-09

R587.1

A

1007-6611(2017)03-0211-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.003