花粉管通道法轉Bar基因胡麻后代的分子檢測

蘇文杰

（通渭縣雞川鎮政府，甘肅 定西 743300）

花粉管通道法轉Bar基因胡麻后代的分子檢測

蘇文杰

（通渭縣雞川鎮政府，甘肅 定西 743300）

以花粉管通道法轉Bar基因胡麻T1代胡麻為研究對象，用CTAB法提取DNA，經PCR分別擴增外源基因Bar基因的片段，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析，篩選Bar基因成功整合到基因組的單株，結果在114個T1系亞麻植株中檢測出5株含有Bar基因的陽性亞麻植株，轉化率為4.4%。探討了花粉管通道法轉Bar基因在亞麻中的應用前景。

花粉管通道法；轉基因；胡麻；PCR檢測

1 前言

油用亞麻，又名胡麻，拉丁學名Linum usitatissimum，屬于亞麻科亞麻屬普通亞麻的一個變種，是一年生或多年生草本植物。油用亞麻是我國五大油料作物之一，主要分布在甘肅、內蒙古、山西、寧夏、河北、新疆及青海等省區。

利用轉基因技術育種可以打破物種間的遺傳障礙，實現優良目的基因的定向轉移，同時具有后代易于穩定、育種周期短等優點，為作物育種和品質改良提供了新的途徑。已報道亞麻遺傳轉化主要采用基因槍導入法和農桿菌侵染法，但這兩種方法都需要經歷組織培養的過程，具有實驗設備配備要求高、操作復雜、周期長、成本高等缺點。花粉管通道法是利用植物授粉后形成的天然花粉通道，經珠心通道，將外源DNA攜入胚囊，從而轉化早期胚胎細胞的方法。它避免了繁瑣的組織培養過程，操作簡單、成本低廉，可直接用于常規育種。自花粉管通道法問世以來，已在水稻等多種植物的遺傳轉化中取得成功，但應用在油用亞麻的遺傳轉化尚未見報道[1]。

Bar基因能使植物抵抗如草丁膦等以PPT為活性成分的除草劑，具有PPT活性的除草劑具有輸導型滅生性，殺草譜廣，對植物的地上部分和地下部分均有枯殺作用，而且在土壤中易被代謝分解，殘留期短，半衰期只有2～3 d。目前，Bar基因已導入水稻、玉米、小麥、大麥、煙草、馬鈴薯、番茄、高粱、燕麥、甘蔗、番術瓜、菜豆、豌豆、棉花等作物[2]。本論文以花粉管通道法導入Bar基因的T1代胡麻材料為研究對象，通過PCR分子檢測手段篩選Bar基因成功整合到基因組的單株，并統計分析轉化效率，為開展胡麻轉基因育種后續研究奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

試驗用花粉管通道法轉Bar基因胡麻T0代由甘肅省農業科學院作物研究所胡麻課題組提供，播種后分單株取樣檢測。

2.1.2 主要試劑

PremixTaq DNA聚合酶、dNTP、DNAMarker均購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR引物由Invitrogen公司合成。

2.1.3 主要儀器

臺式冷凍離心機、基因擴增儀、凝膠成像儀、電泳儀及移液槍。

2.1.4 主要緩沖液配方

CTAB提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)，20 mmol/L EDTA (pH值8.0)，1.5 mol/L NaCl,2% CTAB(W/V)，4%PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V)，PVP和巰基乙醇使用前加入[3]。TE：10mmol/LTris-HCl（pH值8.0），1mmol/LEDTA。6瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(W/V)，40%蔗糖(W/V)。1TAE電泳緩沖液：40 mmol/LTris-乙酸，1 mmol/LEDTA。

2.2 方法

2.2.1CTAB法提取DNA

取樣：摘取T1代114株胡麻的幼嫩組織，然后分管冷藏。

2.2.2PCR擴增

以含有由CaMV35S啟動子、Bar基因和NOS終止子組成的表達框的質粒pG4A作為PCR檢測的陽性對照，未進行轉基因操作的胡麻植株為陰性對照，水做空白對照，用Bar基因引物進行PCR擴增。

反應體系如下：

PCR循環參數：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃后延伸5 min，經32個循環后10℃保存。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

1.5%瓊脂糖電泳點樣總量為6 μL體系，加樣順序為1 μL溴酚蘭+5 μL擴增樣品。

3 結果與分析

3.1 結果

3.1.1PCR陽性植株的鑒定

為了驗證Bar基因的導入與否，將T1代114株胡麻的幼嫩組織摘取分管冷藏，以陽性植株為對照進行PCR分析。從中提取DNA進行Bar基因的擴增，其結果如圖1所示。

1005-2690（2017）03-0117-02

S512.1

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