花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻后代的分子檢測

蘇文杰

（通渭縣雞川鎮(zhèn)政府，甘肅 定西 743300）

花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻后代的分子檢測

蘇文杰

（通渭縣雞川鎮(zhèn)政府，甘肅 定西 743300）

以花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻T1代胡麻為研究對(duì)象，用CTAB法提取DNA，經(jīng)PCR分別擴(kuò)增外源基因Bar基因的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析，篩選Bar基因成功整合到基因組的單株，結(jié)果在114個(gè)T1系亞麻植株中檢測出5株含有Bar基因的陽性亞麻植株，轉(zhuǎn)化率為4.4%。探討了花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因在亞麻中的應(yīng)用前景。

花粉管通道法；轉(zhuǎn)基因；胡麻；PCR檢測

1 前言

油用亞麻，又名胡麻，拉丁學(xué)名Linum usitatissimum，屬于亞麻科亞麻屬普通亞麻的一個(gè)變種，是一年生或多年生草本植物。油用亞麻是我國五大油料作物之一，主要分布在甘肅、內(nèi)蒙古、山西、寧夏、河北、新疆及青海等省區(qū)。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種可以打破物種間的遺傳障礙，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移，同時(shí)具有后代易于穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，為作物育種和品質(zhì)改良提供了新的途徑。已報(bào)道亞麻遺傳轉(zhuǎn)化主要采用基因槍導(dǎo)入法和農(nóng)桿菌侵染法，但這兩種方法都需要經(jīng)歷組織培養(yǎng)的過程，具有實(shí)驗(yàn)設(shè)備配備要求高、操作復(fù)雜、周期長、成本高等缺點(diǎn)。花粉管通道法是利用植物授粉后形成的天然花粉通道，經(jīng)珠心通道，將外源DNA攜入胚囊，從而轉(zhuǎn)化早期胚胎細(xì)胞的方法。它避免了繁瑣的組織培養(yǎng)過程，操作簡單、成本低廉，可直接用于常規(guī)育種。自花粉管通道法問世以來，已在水稻等多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化中取得成功，但應(yīng)用在油用亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化尚未見報(bào)道[1]。

Bar基因能使植物抵抗如草丁膦等以PPT為活性成分的除草劑，具有PPT活性的除草劑具有輸導(dǎo)型滅生性，殺草譜廣，對(duì)植物的地上部分和地下部分均有枯殺作用，而且在土壤中易被代謝分解，殘留期短，半衰期只有2～3 d。目前，Bar基因已導(dǎo)入水稻、玉米、小麥、大麥、煙草、馬鈴薯、番茄、高粱、燕麥、甘蔗、番術(shù)瓜、菜豆、豌豆、棉花等作物[2]。本論文以花粉管通道法導(dǎo)入Bar基因的T1代胡麻材料為研究對(duì)象，通過PCR分子檢測手段篩選Bar基因成功整合到基因組的單株，并統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)化效率，為開展胡麻轉(zhuǎn)基因育種后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

試驗(yàn)用花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻T0代由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所胡麻課題組提供，播種后分單株取樣檢測。

2.1.2 主要試劑

PremixTaq DNA聚合酶、dNTP、DNAMarker均購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR引物由Invitrogen公司合成。

2.1.3 主要儀器

臺(tái)式冷凍離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀、凝膠成像儀、電泳儀及移液槍。

2.1.4 主要緩沖液配方

CTAB提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)，20 mmol/L EDTA (pH值8.0)，1.5 mol/L NaCl,2% CTAB(W/V)，4%PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V)，PVP和巰基乙醇使用前加入[3]。TE：10mmol/LTris-HCl（pH值8.0），1mmol/LEDTA。6瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)(W/V)，40%蔗糖(W/V)。1TAE電泳緩沖液：40 mmol/LTris-乙酸，1 mmol/LEDTA。

2.2 方法

2.2.1CTAB法提取DNA

取樣：摘取T1代114株胡麻的幼嫩組織，然后分管冷藏。

2.2.2PCR擴(kuò)增

以含有由CaMV35S啟動(dòng)子、Bar基因和NOS終止子組成的表達(dá)框的質(zhì)粒pG4A作為PCR檢測的陽性對(duì)照，未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的胡麻植株為陰性對(duì)照，水做空白對(duì)照，用Bar基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體系如下：

PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃后延伸5 min，經(jīng)32個(gè)循環(huán)后10℃保存。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

1.5%瓊脂糖電泳點(diǎn)樣總量為6 μL體系，加樣順序?yàn)? μL溴酚蘭+5 μL擴(kuò)增樣品。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

3.1.1PCR陽性植株的鑒定

為了驗(yàn)證Bar基因的導(dǎo)入與否，將T1代114株胡麻的幼嫩組織摘取分管冷藏，以陽性植株為對(duì)照進(jìn)行PCR分析。從中提取DNA進(jìn)行Bar基因的擴(kuò)增，其結(jié)果如圖1所示。

1005-2690（2017）03-0117-02

S512.1

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